Традиционные методы диффузного культивирования часто не позволяют повторить сложную среду живых органов, что приводит к потере тканеспецифических маркеров и функций. Мы разработали чип с открытым верхом, который сочетает в себе диффузную культуру и микрофлюидный принцип, чтобы точно имитировать микроокружение эпителиальных тканей. Включая биохимические и биомеханические сигналы, которые естественным образом присутствуют в живых органах, но часто игнорируются традиционными моделями in vitro, чип с открытым верхом представляет собой лучшую альтернативу между закрытыми системами.
Сегодня эту процедуру продемонстрирует Адья Панчал, студент-исследователь в моей лаборатории. Для начала поднесите необходимые реагенты под шкаф биобезопасности на льду. Культивируйте тканеспецифические мезенхимальные клетки для получения слияния от 80% до 90%, а затем диссоциируйте клетки с помощью трипсина или других методов в соответствии с рекомендациями производителя.
Измельчите ячейки весом 250 г в течение пяти минут при температуре 24 градуса Цельсия. Ресуспендируйте гранулы ячейки в 225 микролитрах каждый из ледяных 10X EMEM и буфера реконструкции. Смешайте клетки пипеткой и добавьте 1 800 микролитров ледяного раствора Collagen 1.
Затем перемешайте предварительно гель-раствор на льду, пипеткой вверх и вниз пять-шесть раз. Нейтрализуйте предварительно гель-раствор 18 микролитрами одного нормального гидроксида натрия, аккуратно перемешайте пипеткой, а затем введите пипеткой 150 микролитров нагруженного клетками гидрогеля в центральную камеру чипа с открытым верхом, избегая пузырьков. Сгруппируйте чипы в отдельные чашки Петри, включая крышку центрифужной пробирки, заполненную двумя миллилитрами стерильной двойной дистиллированной воды в каждой чашке Петри, и инкубируйте чашки Петри при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Чтобы выполнить поверхностное микроструктурирование стромального гидрогеля, пипеткой нанесите 20 микролитров нейтрализованного раствора предварительного геля Collagen 1 на узорчатую поверхность стерильного штампа, напечатанного на 3D-принтере, и вставьте штамп внутрь камеры с открытым верхом, пока стромальный гидрогель все еще находится в жидкой форме. Удалите остатки гидрогеля, которые могут пролиться из верхней части камеры с открытым верхом, с помощью аспиратора. Сгруппируйте все чипы в отдельные чашки Петри с конической трубчатой крышкой, заполненной водой, как показано ранее.
И инкубируйте все чашки Петри при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 90 минут. В конце инкубации верните стружку обратно в шкаф биобезопасности и аккуратно удалите штампы с помощью прецизионного пинцета, чтобы снизить риск повреждения гидрогеля. Как только культивируемые клетки достигнут слияния от 80% до 90%, диссоциируют клетки с помощью процедур протеолитических ферментов в соответствии с рекомендациями поставщика клеток.
После диссоциации гранулируют клетки центрифугированием и ресуспендируют эпителиальные клетки до соответствующей плотности клеточного фрагмента, как описано в рукописи. Чтобы засеять эпителиальную клетку, перенесите стружку из инкубатора в шкаф биобезопасности и трижды промойте поверхность стромы 100 микролитрами свежей среды для культивирования эпителиальных клеток, чтобы удалить излишки раствора покрытия. После аспирации промывочной среды засейте поверхность гидрогеля 50 микролитрами суспензии эпителиальных клеток, используя соответствующую плотность клеток, а затем перенесите стружку обратно в инкубатор на два часа.
Чтобы удалить клеточный мусор, аккуратно промойте поверхность гидрогеля питательной средой для клеточных культур дважды, обновите среду путем автоклавирования в герметичных автоклавируемых контейнерах и подсоедините стружку к перистальтическому насосу. Поставьте перистальтический насос на паузу, осторожно отсоедините стружку от насоса и извлеките держатель корпуса стружки. После переноса чипсов из инкубатора в шкаф биобезопасности удалите объем среды, оставшийся в верхнем резервуаре.
Затем осторожно аспирируйте всю среду из верхнего микрофлюидного канала и зажмите короткую микрофлюидную трубку, соединенную с верхними входными отверстиями, с помощью связующих зажимов, чтобы уменьшить испарение среды и обслуживание границы раздела воздух-жидкость или ALI. Поместите чип с открытым верхом на держателе корпуса обратно в инкубатор. Снова подключите стружку к перистальтическому насосу и возобновите поток, запустив перистальтический насос.
Промойте сосудистую камеру средой для культивирования эндотелиальных клеток, а затем засейте 25 микролитров суспензии эндотелиальных клеток. Переверните чипы вверх дном, чтобы эндотелиальные клетки прикрепились к верхней поверхности микрофлюидной камеры. Сгруппируйте чипсы в чашки Петри.
Поместите их обратно в инкубатор, как показано ранее, и дайте эндотелиальным клеткам прикрепиться в течение одного часа. По окончании инкубации перенесите чипсы из инкубатора в шкаф биобезопасности и дважды промойте сосудистый канал средой для культивирования эндотелиальных клеток для удаления клеточного мусора. Уложите стружку ровно, чтобы облегчить адгезию эндотелиальных клеток к нижней поверхности сосудистого канала.
Заполните резервуар сосудистой среды дегазированной средой для культивирования сосудистых клеток под шкафом биобезопасности. Поместите микросхемы обратно в держатель корпуса микросхемы и снова подсоедините микросхемы к средним резервуарам на одном конце и к перистальтическому насосу на другом. Осмотрите микрофлюидные соединения, чтобы убедиться, что все микросхемы правильно подключены и на них не капают видимые капли среды.
Затем возобновите поток жидкости, запустив перистальтический насос. Визуализируется поверхность геля с микрорисунком с клетками и без них. Гистологический анализ выявил зрелый многослойный слоистый эпидермис, дифференцированный на чипе.
Снимок кожного чипа сверху показал наличие фибробластов внутри дермального слоя. PECAM-1, VE-кадгерин и фон Виллебранд показали дифференцировку микрососудистых эндотелиальных клеток человека, совместно культивируемых в кожном чипе с открытым верхом. Флуоресцентное окрашивание MUC5AC, альфа- и бета-тубулин, хлорклеточный белок 16, p63 и флуоресцентное окрашивание ZO-1 показали зрелый эпителий дыхательных путей.
Биение ресничек и дифференцированный зрелый псевдостратифицированный эпителий наблюдались на чипе дыхательных путей с открытым верхом. Флуоресцентное окрашивание типа I, типа II и E-кадгерина показало наличие зрелых пневмоцитов на чипе. Электронная микроскопия выявила наличие микроворсинок и лизосомальных везикул, свидетельствующих о зрелом альвеолярном фенотипе.
Гистологический анализ показал наличие плоских плоскоклеточных клеток, соответствующих фенотипу I типа, и кубовидных булыжниковых клеток, когерентных с фенотипом II типа, и фибробластов внутри дермального слоя. Наличие энтероцитов и зрелого бокаловидного сустава было подтверждено окрашиванием муцином 2 и Е-кадгерином. Фибробласты внутри дермального слоя подтвердили наличие простого столбчатого эпителия.
Все реагенты должны быть холодными, а поверхности геля должны быть надлежащим образом промыты для получения ровной поверхности. Важно удалить все неприлипшие клетки и мусор, чтобы получить равномерную клеточную адгезию и компактный грязный монослой и сосудистую стенку. Аналогичный подход может быть использован для создания других типов моделей эпителиальных органов, таких как кишечник и легкие, чтобы оценить, как конкретные лекарства или факторы окружающей среды могут влиять на гомеостаз тканей человека, с особым акцентом на функцию эпителия и сосудистого барьера.
Благодаря легкому доступу к фазе эффективности компартмента стромы, исследования теперь могут генерировать определенные узоры лица и воспроизводить функциональную архитектуру ткани, такую как криптвивеоли, чего трудно достичь с помощью других устройств.
