Онколитический вирус простого герпеса является новой формой иммунотерапии рака. Эффективная система распространения, очистки и титрования вирусов имеет решающее значение для использования в экспериментальных исследованиях. Этот метод очень прост и может быть легко принят в любых лабораторных условиях второго уровня биобезопасности для получения высококачественного вирусного запаса для доклинических исследований.
Производство высококачественного, чистого вирусного запаса имеет решающее значение, поскольку оно используется для изучения противоопухолевого иммунного ответа и разработки новой формы иммунотерапии рака на основе вируса. Этот протокол может быть использован для очистки любого вируса дикого типа или генетически модифицированного вируса простого герпеса. Этот протокол должен быть легко читаемым и легким для подражания для человека, который никогда не выполнял эту технику раньше.
Перечисленные материалы и реагенты должны быть на месте, прежде чем пробовать эту технику в первый раз. Начните с промывки колб Т-150 квадратных сантиметров с двукратно высоким содержанием глюкозы DPBS, дополненным 1% IFCS. Аспирировать DPBS и добавить семь миллилитров вирусного инокулята на колбу.
Осторожно качайте колбы в течение пяти минут и высиживая при 37 градусах Цельсия в течение 1,5-2 часов. Затем удалите инокулят и добавьте 25 миллилитров DMEM, дополненных 1% IFCS в каждую колбу. После инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух-четырех дней собирают 20 миллилитров супернатанта культуры из каждой колбы в 50-миллилитровые центрифужные трубки.
С помощью скребка для ячеек соскоблите ячейки со дна колб. Добавьте примерно 15 миллилитров ранее собранного культивального супернатанта в каждую колбу, чтобы довести объем до 20 миллилитров, затем используйте 10-миллилитровую стерильную серологическую пипетку, чтобы аккуратно промыть дно колб несколько раз. Соберите ячейки со средой в 50 миллилитровые конические центрифужные трубки, помещенные на лед.
Центрифугировать трубки в 300 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно повторно суспендируют каждую гранулу в 1,25 миллилитрах вирусного буфера, или VB, и 1,25 миллилитрах ранее собранного культивируемого супернатанта. Смешайте все повторно суспендированные гранулы в одной конической центрифужной трубке емкостью 50 миллилитров.
Заморозьте повторно суспендированные ячейки с использованием сухого льда и 100% этанола и храните при минус 80 градусах Цельсия. Разморозить ранее щелкнувшие замороженные клетки на теплой водяной бане при 37 градусах Цельсия и обрабатывать ультразвуком в течение одной минуты в течение трех циклов на водяной бане. Добавьте 175 единиц нуклеазы бензоназы и два микролитра двух миллимоляров хлорида магния на миллилитр клеточного лизата и вихря.
После инкубации 30 минут и теплой водяной бани при 37 градусах Цельсия поместите трубку на лед. Раскрутите лисат клетки в 300 раз g в течение 10 минут. Соберите супернатант в новую 50-миллилитровую коническую центрифужную трубку и повторно суспендировать ячейку гранулы в 500 микролитрах VB. Обозначьте его как гранулированный один.
Снова вращайте собранный супернатант в 500 раз G в течение 10 минут и храните супернатант отдельно в свежей конической центрифужной трубке объемом 50 миллилитров для последующего использования. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 500 микролитров VB, обозначив ее как гранулу две. Смешайте повторно суспендированную гранулу один и гранулу два в новой 1,75-миллилитровой центрифужной трубке и дважды вихревой и ультразвуком на водяной бане, прежде чем вращать трубки со скоростью 400 G в течение 10 минут.
Соберите супернатант из 1,7-миллилитровой центрифужной трубки и соедините его с ранее собранным 50-миллилитровой конической центрифужной трубкой. Отфильтруйте супернатант через стерильный пятимикрометровый мембранный фильтр PVDF в новую 50-миллилитровую центрифужную трубку, называемую трубчатой. Добавьте один миллилитр VB в 50-миллилитрную центрифужную трубку, опорожненную после фильтрации супернатанта с предыдущей ступени, вихря, и пропустите его через тот же мембранный фильтр PVDF, размещенный на трубчатом.
Пропустите фильтрат из трубки один через стерильный мембранный фильтр MCE размером 0,8 микрометра, помещенный на новую 50-миллилитровую центрифужную трубку, называемую трубкой два. Добавьте один миллилитр VB к опорожненной трубке, вихревой, и пропустите его через тот же фильтр MCE, размещенный на трубке два. Пропустите фильтрат из трубки два через стерильный 0,45-микрометровый PVDF-фильтр, размещенный на новой 50-миллилитровой центрифужной трубке с маркировкой трубки три.
Как описано выше, повторите промывку трубки два с одним миллилитром VB, чтобы добавить фильтрат в три трубы. В этом репрезентативном анализе цитопатический эффект можно было наблюдать в клетках Vero через 36, 48 и 72 часа после инфекции oHSV с округлением пораженных клеток. Возрастающий уровень CPE с течением времени очевиден, как визуализируется выражением mCherry.
Через 72 часа после заражения вирусные бляшки окрашивали X-gal для визуализации oHSV с экспрессией lacZ. Осторожное удаление инфицированных вирусом клеток и осторожное промывание дна на колбе имеет решающее значение для сохранения всех инфицированных ВПГ клеток нетронутыми, чтобы можно было получить вирусный запас с высоким титром.
