Подкожная вена внезапно подвергается артериальным заболеваниям после операции аортокоронарного шунтирования. Понимание его адаптационной реакции на механический стресс может помочь в разработке терапевтических инструментов для предотвращения отторжения венозного трансплантата. Этот протокол выделения эндотелиальных клеток очень прост и требует только инкубации с коллагеназой.
При минимальных манипуляциях с сосудами это приводит к уменьшению загрязнения гладкомышечными клетками и фибробластами. Протокол выделения SVEC человека и их культивирования в условиях напряжения сдвига и циклического растяжения имеет важное значение для понимания вклада механических сил в дисфункцию эндотелиальных клеток, связанную с недостаточностью трансплантата подкожной вены. Предшествующая культура эндотелиальных клеток очень требовательна к добавкам клеточных сред.
Обязательно добавление факторов роста, чтобы успешно изолировать культуру, человеческие SVEC. Для выделения первичных эндотелиальных клеток подкожной вены человека или SVEC человека собирают сегмент подкожной вены длиной не менее двух-трех сантиметров. Работая под стерильным вытяжным шкафом с ламинарным потоком, перенесите сегмент вены в чашку Петри, наполненную предварительно разогретым PBS.
Чтобы удалить всю кровь изнутри просвета, вставьте наконечник пипетки, прикрепленный к пипетке и заполненный PBS, в один конец вены и осторожно промойте его. Промывайте его до тех пор, пока поток стирки не станет полностью прозрачным. Затем закройте один конец вены стерильным ватным швом.
Осторожно заполните сосуд раствором коллагеназы 2-го типа из расчета один миллиграмм на миллилитр и закройте другой конец сосуда ватным швом. Инкубируйте сосуд с раствором коллагеназы в увлажненной атмосфере 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем отрежьте один конец сосуда над 15-миллилитровой трубкой, чтобы собрать раствор коллагеназы, прежде чем отрезать другой конец.
Промойте поверхность просвета одним-двумя миллилитрами PBS, чтобы собрать все отделившиеся эндотелиальные клетки внутри трубки с помощью коллагеназы. Центрифугируйте пробирку при 400 г при комнатной температуре в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать клеточную гранулу в трех-четырех миллилитрах полной эндотелиальной клеточной среды, содержащей дополнительный раствор гепарина.
Поместите клетки в 60-миллиметровую чашку для культивирования клеток, предварительно покрытую желатином 3% по объему. Инкубируют клетки в увлажненной атмосфере в течение четырех дней, не меняя среду. После этого меняйте среду через день, не добавляя добавки гепарина.
Исследуйте пластину под микроскопом, чтобы убедиться, что эритроциты были удалены. Через один-четыре дня после экстракции, в зависимости от размера и диаметра сегмента вены, визуализируйте SVEC человека с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы оценить степень слияния и морфологию их булыжника. Продолжайте менять среду каждые два дня, пока ячейки не достигнут слияния от 70% до 80%.
Покройте предметное стекло проточной камеры желатином 0,1% веса на объем и выдерживайте не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы уравновесить жидкостный блок и стерильный перфузионный набор, имеющий 10-миллиметровые резервуары, инкубируйте их в течение ночи в увлажненной атмосфере. Для эксперимента с напряжением сдвига 200 000 эндотелиальных клеток, взвешенных в 100 микролитрах питательной среды, помещают в предметное стекло проточной камеры, покрытое желатином.
Чтобы прикрепить клетки к поверхности культуры, инкубируйте клетки в течение четырех часов. Поместите перфузионный набор на жидкостный блок. Заполните резервуары и перфузионный набор примерно 12 миллилитрами предварительно подогретой полной среды эндотелиальных клеток.
Удалите пузырьки воздуха из перфузионного набора, чтобы уравновесить уровень обоих резервуаров на уровне пяти миллилитров. Поместите жидкостный блок на установленный перфузионный комплект без затвора камеры в инкубаторе и подключите его электрический кабель к насосу с компьютерным управлением. Запустив предварительно заданный протокол в программном обеспечении управления насосом, удалите все пузырьки воздуха из резервуаров и перфузионной установки.
Возьмите жидкостный блок с установленным перфузионным устройством на колпаке с ламинарным потоком и прикрепите предметные стекла с монослоем ячейки слияния. Поместив весь блок с горками в инкубатор, подсоедините его электрический кабель к насосу. В программном обеспечении управления насосом отрегулируйте настройку жидкостного агрегата, выбрав тип суппорта и установив вязкость среды.
В параметрах потока введите значение напряжения сдвига и установите продолжительность цикла и тип потока. Затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать эксперимент. Не забывайте поддерживать слайд с ячейками, обработанными той же средой, без воздействия потока, что и статические элементы управления.
Нанесите смазку на основе силикона на верхнюю и боковые стороны 25-миллиметровой 6-луночной равноосной загрузочной станции. Засейте 400 000 клеток, взвешенных в трех миллилитрах, к каждой лунке из 6-луночных культуральных пластин с гибким дном, покрытых коллагеновой. Инкубируйте клетки в увлажненном воздухе до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния.
Перед началом протокола растяжки промойте клетки один раз предварительно подогретым PBS и добавьте по три миллилитра свежей питательной среды на лунку. Вставьте опорную плиту со всеми смазанными загрузочными станциями в инкубатор и соответствующим образом соедините трубку с управляющим оборудованием системы растяжения натяжных ячеек. Прикрепите каждую культуральную пластину к одной красной прокладке, предусмотренной системой биореактора.
Затем поместите их в опорную пластину в инкубаторе. Поместите все четыре культуральные пластины в опорную плиту, чтобы добиться надлежащего вакуума и растягивающей нагрузки. Включите оборудование контроллера и компьютерную систему.
Откройте управляющее программное обеспечение FlexCell и настройте желаемый режим, включая процент удлинения, форму волны, частоту и время. Сохраните схему. Включите вакуумную систему, затем выберите режим и нажмите «Пуск» на экране компьютера, чтобы запустить растяжку.
Убедитесь, что силиконовая мембрана движется и растягивает клетки. Прилипшие эндотелиальные клетки можно было наблюдать через 4-10 дней после экстракции. Первоначально они образуют клеточные кластеры, демонстрирующие типичную морфологию булыжника.
Они экспрессировали ЕС-маркеры CD31 и VE-кадгерин. hSVEC при культивировании под напряжением сдвига выравниваются по направлению потока. Напряжение сдвига 20 дин на квадратный сантиметр в течение 72 часов индуцирует экспрессию типичных механочувствительных генов KLF2, KLF4 и NOS3, что указывает на эффективность стимула сдвига.
Результат циклического растяжения зависел от интенсивности, приложенной к человеческим SVEC. Клетки при низком растяжении показали корковый F-актиновый паттерн, похожий на статические клетки. Без изменения высвобождения оксида азота в течение 72 часов наши артериальные уровни растяжения ремоделировали актиновый цитоскелет через 24 часа и уменьшали высвобождение NO через 72 часа.
Помимо исследований механического стресса, исследователи могут использовать изолированные клетки для выполнения различных методов для расширения знаний о функции и дисфункции эндотелиальных клеток. Следуя продемонстрированному протоколу, можно изучать любой другой тип эндотелиальных клеток при напряжении сдвига и растяжении.
