Мышиная модель, использованная в этом исследовании, эффективно моделирует влияние хронического приема никотина и повторного воздействия диоксида кремния на фиброзы легких через эпителиальный мезенхимальный переход у людей. Модель порции жюри была достигнута путем подкожной инъекции никотина и назального капельного введения диоксида кремния простым и надежным способом. Суспендировать стерильный кристаллический диоксид крема в физиологическом растворе для приготовления суспензии 20 миллиграмм на литр.
Колеблйте его на ультразвуковой встряхивающей водяной бане в течение 25 минут. Поместите кремнеземную суспензию с вихревым осциллятором на три минуты. Аспирируйте суспензию, чтобы перемешать ее, а затем используйте 50 микролитров для капельницы из носа.
Чтобы начать воздействие диоксида кремния, сначала положите обезболиваемую мышь на ладонь одной руки и обнажите носовую полость мыши. Введите 50 микролитров кремнеземной суспензии из одной ноздри в течение четырех-восьми секунд. Чтобы обеспечить быстрое проникновение в легкие суспензии, осторожно надавите на грудную клетку мыши указательным пальцем в течение трех-пяти секунд, повторяя нажатие три-пять раз в секунду, чтобы поддерживать частоту дыхания.
Как только мышь начнет дышать равномерно, поместите ее под наблюдение в клетку на три минуты. Подготовьте никотиновые шприцы, втягивая воздух до отметки 0,2 миллилитра в шприц объемом один миллилитр. Затем наберите 125 микролитров никотина.
Постучите по шприцу, чтобы наполнить иглу и передний конец никотином, а затем поместите его в лоток, защищенный от света. Правой рукой возьмитесь за хвост мыши. Когда мышь расслабится, большим и указательным пальцами левой руки надавите на кожу от хвоста до края уха.
Теперь отпустите правую руку и используйте левый, маленький и безымянный пальцы, чтобы зажать хвост и задние конечности, чтобы обездвижить мышь. Держите шприц для инъекций в правой руке и прокалывайте кожу на задней части шеи в направлении головы к хвосту. Вводите никотин с равномерной скоростью.
Зафиксируйте обезболиваемую мышь на поролоновой тестовой пластине и опрыскайте шерсть 75%-ным спиртом. Сделайте разрез по средней линии живота, обнажив грудную полость. Сделайте небольшой надрез на верхушке правой стороны сердца.
Медленно и равномерно введите 20 миллилитров предварительно охлажденного PBS из верхушки левого сердца, заставляя кровь вытекать из отверстия, созданного на верхушке правого сердца. Удалите всю долю легкого и поставьте в холодильник при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Прокормите оставшихся мышей 10 миллилитрами 4%-ного параформальдегида.
После перфузии PBS законсервируйте легкие в 30 миллилитрах раствора параформальдегида. Через 72 часа погрузите легкие в приготовленный фиксатор и поместите их на ультразвуковую водяную баню. Выдерживается при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем выполните обезвоживание, поместив ткань в 75%-ный этанол, затем в 95%-ный этанол, а затем в безводный этанол на 50 минут каждый. Погрузите легочную ткань в ксилол на 50 минут дважды, чтобы промыть ткани. Поместите ткань в расплавленный парафин на два-три часа при температуре от 55 до 60 градусов по Цельсию.
После того, как воск затвердеет, используйте секционную машину, чтобы получить срезы легких толщиной от четырех до пяти микрометров. Нагрейте секции до 45 градусов Цельсия в сверхчистой воде. Поместите срезы легких на предметное стекло микроскопа, как только воск расплавится.
Исследования по окрашиванию гематоксилином и эозином показали, что у мышей, подвергшихся воздействию никотина в сочетании с диоксидом кремния, наблюдалось значительно более серьезное повреждение легких, чем у мышей, подвергшихся воздействию только никотина или диоксида кремния. Окрашивание по Массону выявило повышенное отложение коллагеновых волокон в легких, подвергшихся воздействию комбинации никотинового кремнезема, по сравнению с другими группами. Альвеолярные структуры были разрушены у мышей, подвергшихся воздействию кремнезема.
Иммуногистохимические исследования выявили повышенный уровень CD two zero six positive макрофагов и профибротического фактора, TGF beta one положительных клеток у мышей, подвергшихся воздействию комбинации никотина и диоксида кремния. Экспрессия виментина была выше у мышей, подвергшихся двойной экспрессии, по сравнению с другими группами. Иммуногистохимические исследования и количественное определение белков свидетельствуют о выраженной мезенхимальной трансформации эпителия.
Чтобы обеспечить успешную инъекцию никотина, оператор должен научиться хватать мышей, так как захват кожи в задней части шеи может быть болезненным для них.
