Das in dieser Studie verwendete Mausmodell simuliert effektiv die Wirkung von chronischer Nikotinaufnahme und wiederholter Exposition gegenüber Kieselsäure auf Lungenfibrosen durch epitheliale mesenchymale Transition beim Menschen. Das Jury-Portionsmodell wurde durch subkutane Injektion von Nikotin und den nasalen Tropf von Kieselsäure auf einfache und zuverlässige Weise erreicht. Suspendieren Sie steriles kristallines Siliziumdioxid in Kochsalzlösung, um eine Suspension von 20 Milligramm pro Liter herzustellen.
Oszillieren Sie es 25 Minuten lang in einem Ultraschall-Schüttelwasserbad. Stellen Sie die Silica-Suspension für drei Minuten mit einem Vortex-Oszillator auf. Saugen Sie die Suspension an, um sie zu mischen, und verwenden Sie dann 50 Mikroliter für den Nasentropf.
Um mit der Kieselsäure-Exposition zu beginnen, legen Sie die betäubte Maus zunächst auf die Handfläche einer Hand und legen Sie die Nasenhöhle der Maus frei. Injizieren Sie 50 Mikroliter der Silica-Suspension innerhalb von vier bis acht Sekunden aus einem Nasenloch. Um ein schnelles Eindringen der Suspension in die Lunge zu ermöglichen, drücken Sie mit dem Zeigefinger drei bis fünf Sekunden lang vorsichtig auf die Brust der Maus und wiederholen Sie den Druck drei- bis fünfmal pro Sekunde, um die Atemfrequenz aufrechtzuerhalten.
Sobald die Maus eine gleichmäßige Atmung zeigt, setzen Sie sie drei Minuten lang in einen Käfig. Bereiten Sie Nikotinspritzen vor, indem Sie Luft bis zur Markierung von 0,2 Milliliter in eine Ein-Milliliter-Spritze ziehen. Dann 125 Mikroliter Nikotin aufziehen.
Klopfen Sie auf die Spritze, um die Nadel und das vordere Ende mit Nikotin zu füllen, und legen Sie sie dann in eine lichtgeschützte Schale. Greife mit der rechten Hand den Schwanz der Maus. Wenn sich die Maus entspannt hat, üben Sie mit dem linken Daumen und Zeigefinger einen mäßigen Druck auf die Haut vom Schwanz bis zum Rand des Ohrs aus.
Lassen Sie nun die rechte Hand los und kneifen Sie mit dem linken, kleinen und Ringfinger in den Schwanz und die Hintergliedmaßen, um die Maus bewegungsunfähig zu machen. Halten Sie die Injektionsspritze in der rechten Hand und stechen Sie die Haut im Nacken von Kopf zu Schwanz ein. Injizieren Sie das Nikotin mit einer gleichmäßigen Rate.
Fixieren Sie die betäubte Maus auf einer Schaumstofftestplatte und besprühen Sie das Fell mit 75%igem Alkohol. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches, der die Brusthöhle freilegt. Mache einen kleinen Schnitt an der Spitze der rechten Seite des Herzens.
Injizieren Sie 20 Milliliter vorgekühltes PBS langsam und gleichmäßig von der Spitze des linken Herzens, wodurch Blut aus der Öffnung an der Spitze des rechten Herzens fließt. Entnehmen Sie den gesamten Lungenlappen und stellen Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius in den Kühlschrank. Die restlichen Mäuse werden mit 10 Millilitern 4%para-Formaldehyd perfundiert.
Konservieren Sie die Lunge nach der PBS-Perfusion in 30 Millilitern der Para-Formaldehyd-Lösung. Nach 72 Stunden tauchen Sie die Lunge in das vorbereitete Fixiermittel und legen Sie sie in ein Ultraschall-Wasserbad. 30 Minuten bei 40 Grad Celsius temperiert.
Als nächstes führen Sie eine Dehydrierung durch, indem Sie das Gewebe für jeweils 50 Minuten in 75%iges Ethanol, dann in 95%iges Ethanol und dann in wasserfreies Ethanol legen. Tauchen Sie das Lungengewebe zweimal 50 Minuten lang in Xylol, um das Gewebe zu waschen. Legen Sie das Gewebe für zwei bis drei Stunden bei 55 bis 60 Grad Celsius in geschmolzenes Paraffinwachs.
Sobald das Wachs ausgehärtet ist, verwenden Sie eine Trennmaschine, um die vier bis fünf Mikrometer dicken Lungenschnitte zu erhalten. Erhitzen Sie die Abschnitte bei 45 Grad Celsius in Reinstwasser. Legen Sie die Lungenabschnitte auf einen anhaftenden Objektträger, sobald das Wachs geschmolzen ist.
Hämatoxylin- und Eosin-Färbestudien zeigten, dass Mäuse, die Nikotin in Kombination mit Kieselsäure ausgesetzt waren, signifikant schwerere Lungenschäden aufwiesen als diejenigen, die entweder Nikotin oder Kieselsäure allein ausgesetzt waren. Massons Färbung ergab eine erhöhte Kollagenfaserablagerung in der Lunge, die im Vergleich zu den anderen Gruppen einer Nikotin-Kieselsäure-Kombination ausgesetzt war. Die Alveolar-Strukturen wurden in den Kieselsäure-exponierten Mäusen zerstört.
Immunhistochemische Untersuchungen zeigten bei den Mäusen, die der Kombination von Nikotin und Kieselsäure ausgesetzt waren, erhöhte CD-2-Null-Sechs-positive Makrophagen und den pro-fibrotischen Faktor, TGF-beta-eins-positive Zellen. Die Vimentin-Expression war bei Mäusen, die der dualen Expression ausgesetzt waren, im Vergleich zu den anderen Gruppen höher. Immunhistochemische Untersuchungen und Proteinquantifizierung deuten auf eine schwere epitheliale mesenchymale Transformation hin.
Um eine erfolgreiche Nikotininjektion zu gewährleisten, muss sich der Bediener mit dem Greifen der Mäuse vertraut machen, da das Greifen der Haut im Nacken für sie schmerzhaft sein kann.
