O modelo de camundongo empregado neste estudo simula efetivamente o efeito da ingestão crônica de nicotina e da exposição repetida à sílica sobre as fibroses pulmonares através da transição mesenquimal epitelial em seres humanos. O modelo de porção do júri foi obtido pela injeção subcutânea de nicotina e gotejamento nasal de sílica de forma simples e confiável. Suspender a sílica cristalina estéril em soro fisiológico para preparar uma suspensão de 20 miligramas por litro.
Oscile-o em um banho de água de agitação ultra-sônica por 25 minutos. Coloque a suspensão de sílica com um oscilador de vórtice por três minutos. Aspirar a suspensão para misturá-la e, em seguida, usar 50 microlitros para o gotejamento nasal.
Para iniciar a exposição à sílica, primeiro, coloque o camundongo anestesiado na palma de uma das mãos e exponha a cavidade nasal do camundongo. Injetar 50 microlitros da suspensão de sílica de uma narina dentro de quatro a oito segundos. Para permitir uma rápida penetração pulmonar da suspensão, pressione suavemente o peito do mouse com o dedo indicador por três a cinco segundos, repetindo a pressão de três a cinco vezes a cada segundo para manter sua frequência respiratória.
Uma vez que o mouse exibe respiração uniforme, coloque-o sob observação em uma gaiola por três minutos. Prepare seringas de nicotina retirando o ar até a marca de 0,2 mililitro em uma seringa de um mililitro. Em seguida, retire 125 microlitros de nicotina.
Bata na seringa para encher a agulha e a extremidade frontal com nicotina e, em seguida, coloque-a em uma bandeja protegida da luz. Com a mão direita, segure a cauda do rato. Quando o mouse tiver relaxado, use o polegar esquerdo e o indicador para aplicar pressão moderada na pele da cauda até a borda da orelha.
Agora, solte a mão direita e use os dedos esquerdo, pequeno e anelar para beliscar a cauda e os membros posteriores para imobilizar o mouse. Segure a seringa de injeção na mão direita e puncione a pele na parte de trás do pescoço na direção da cabeça à cauda. Injetar a nicotina em uma taxa uniforme.
Fixe o rato anestesiado numa placa de teste de espuma e borrife o pelo com álcool a 75%. Faça uma incisão ao longo da linha média do abdome expondo a cavidade torácica. Faça um pequeno corte no ápice do lado direito do coração.
Injete 20 mililitros de PBS pré-resfriado lenta e uniformemente a partir do ápice do coração esquerdo, fazendo com que o sangue flua para fora da abertura criada no ápice do coração direito. Retire todo o lobo pulmonar e leve à geladeira a 80 graus Celsius negativos. Perfundir os ratos restantes com 10 mililitros de para-formaldeído a 4%.
Após a perfusão PBS, preservar os pulmões em 30 mililitros da solução de para-formaldeído. Após 72 horas, mergulhe os pulmões no fixador preparado e coloque-os em banho-maria ultrassônico. Temperado a 40 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, realizar a desidratação colocando o tecido em etanol 75%, depois em etanol 95% e, em seguida, em etanol anidro por 50 minutos cada. Mergulhe o tecido pulmonar em xileno por 50 minutos duas vezes para lavar o tecido. Coloque o tecido em cera de parafina derretida por duas a três horas a 55 a 60 graus Celsius.
Uma vez endurecida a cera, use uma máquina de seccionamento para obter os cortes de pulmão de quatro a cinco micrômetros de espessura. Aqueça as seções a 45 graus Celsius em água ultrapura. Coloque os cortes pulmonares em uma lâmina de microscópio aderente assim que a cera derreter.
Estudos de coloração de hematoxilina e eosina mostraram que camundongos expostos à nicotina combinada com sílica tiveram danos pulmonares significativamente mais graves do que aqueles expostos à nicotina ou à sílica isoladamente. A coloração de Masson revelou aumento da deposição de fibras colágenas nos pulmões expostos à combinação de sílica nicotina em relação aos outros grupos. Estruturas alveolares foram destruídas nos camundongos expostos à sílica.
Estudos imuno-histoquímicos revelaram aumento de CD dois zero seis macrófagos positivos e do fator pró-fibrótico, TGF beta um positivo nos camundongos expostos à combinação de nicotina e sílica. A expressão de vimentina foi maior nos camundongos submetidos à dupla expressão em relação aos demais grupos. Estudos imuno-histoquímicos e quantificação de proteínas sugerem transformação mesenquimal epitelial grave.
Para garantir uma injeção de nicotina bem-sucedida, o operador tem que se familiarizar com agarrar os ratos, pois agarrar a pele na parte de trás do pescoço pode ser doloroso para eles.
