Исследования расстройств, которые в первую очередь затрагивают людей женского пола, недостаточно изучены и недостаточно финансируются. Пролапс тазовых органов – это заболевание, тесно связанное с женским полом. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище.
Мало что известно о клеточных взаимодействиях в контексте этой патофизиологии, а также о том, как факторы на уровне тканей влияют на успех хирургических вмешательств. Выделение первичных фибробластов из влагалища человека может быть полезным для изучения биологических механизмов, лежащих в основе опущения тазовых органов. Пролапс тазовых органов обычно поражает пожилых людей или лиц в постменопаузе.
Изучение выделения и пролиферации первичных фибробластов этого состояния затруднено из-за снижения клеточных популяций и клоногенной способности более старых доноров. В большинстве работ с использованием образцов человеческого влагалища используются ткани женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов. Хотя в нескольких работах сообщалось об использовании образцов как в пременопаузе, так и в постменопаузе, они не описывали достаточно подробно протокол, используемый для успешной изоляции фибробластов от пожилых доноров или доноров в постменопаузе.
Выделение и моделирование заболевания с использованием фибробластов из тканей постменопаузы может иметь важное значение для понимания клеточной патофизиологии пролапса тазовых органов, поскольку это состояние имеет наибольшую распространенность у людей в течение десятилетия после менопаузы. В этой статье описан надежный протокол о том, как приобрести вагинальные фибробласты человека в постменопаузе или стареющем состоянии. Собранные ткани были проанализированы гистологически для валидации протокола.
Измерьте и разрежьте ткань до размера примерно одного квадратного сантиметра. Обеспечьте точное измерение размера биопсии. Подготовьте две-три дополнительные биопсии влагалища, измеряя один квадратный сантиметр каждая, от одного донора и отложите биопсию.
После помещения биопсии влагалища в чашку Петри для клеточной культуры измельчите ткань влагалища на мелкие фрагменты, используя два стерильных скальпеля. Убедитесь, что кончики лезвий расположены перпендикулярно поверхности ткани. Равномерное и равномерное давление надавите на поверхность ткани с помощью двух скальпелей.
Выполняйте попеременное тянущее действие, чтобы разрезать ткани на очень мелкие кусочки. Повторяйте эту технику измельчения с помощью двух скальпелей до тех пор, пока образец не станет однородным по консистенции из одного-двух миллиметровых кусочков. Добавьте в тарелку два-три миллилитра бессывороточной клеточной питательной среды, суспензируя измельченную ткань.
Пипеткой впрыскивайте раствор, содержащий фрагменты ткани, вверх и вниз, чтобы разбить любые комки. Переложите раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавляйте дополнительные бессывороточные среды для клеточных культур до тех пор, пока общий объем не составит 10 миллилитров.
Храните Либеразе в 230 микролитровых аликвотах для использования. Добавьте в тюбик 230 микролитров Либераче. Инкубируйте пробирки в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном энергичном перемешивании, используя смеситель для образцов.
Поддерживайте постоянное возбуждение. Делайте вихревые движения трубок с 30-минутными интервалами во время инкубации. Центрифугируйте образцы в течение пяти минут при 3000 G. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в одном-двух миллилитрах среды для клеточных культур с 10% фетальной бычьей сывороткой для разбавления либеразы. Энергично пипетируйте до тех пор, пока гранула не будет полностью восстановлена. Процедите суспензию тканевого фермента, аккуратно нанеся раствор пипетированием на клеточное ситечко.
Соберите клеточные суспензии из нескольких биопсий тканей одного и того же донора. С помощью поршня стерильного пятимиллилитрового шприца продавите через ткань суспензию фермента над ситечком. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока оставшиеся фрагменты ткани не будут полностью продавлены.
Пластина извлекала клеточную суспензию из нескольких биопсий влагалища от одного и того же донора на одной чашке Петри. После ночной инкубации при 37 градусах Цельсия наблюдайте за клетками с помощью фазово-контрастного микроскопа. Обеспечьте фокусировку микроскопа на нижней части пластины.
Небольшое количество фибробластов будет прикреплено к дну. Ниже приведено схематическое представление протокола с выделением ключевых шагов. На втором рисунке показано фазово-контрастное изображение взвешенных клеток в нулевой день.
На рисунке 3 представлено фазово-контрастное изображение первичных фибробластов влагалища на 14-й день посева при 100-кратном увеличении из вытянутой суспензии трех биопсий ткани площадью один сантиметр квадратный. В таблице 1 представлены результаты использования других протоколов для попытки выделения вагинальных фибробластов в данном исследовании. Фибробласты были идентифицированы по положительному окрашиванию ментона.
Иммунофлуоресцентный анализ был проведен на тканях влагалища в пременопаузе и постменопаузе, показанных здесь. Снимки были сделаны с 200-кратным увеличением. Выделенные фибробласты также окрашивали альфа-гладкомышечным актином и F-актином в образцах тканей в пременопаузе и постменопаузе.
Мы разработали оптимизированный и надежный протокол выделения первичных фибробластов из слизистой оболочки влагалища у пожилых доноров. Использование ранее опубликованных протоколов для тканей животных и человека для диссоциации первичных клеток не привело к извлечению фибробластов из образцов влагалища человека в данном исследовании. Мы предполагаем две вероятные причины проблем с диссоциацией клеток из тканей влагалища человека.
Толщина слизистой оболочки кожи у пожилых доноров больше у пожилых доноров и по сравнению с толщиной ткани, не относящейся к слизистой оболочке, а плотность фибробластов может быть заметно снижена у пожилых людей. Не следует изменять несколько критически важных шагов. Осуществление очень строгого механического разложения с использованием техники двух скальпелей и объединение клеточных суспензий трех-четырех биопсий полной толщины одного донора.
Наш протокол имеет явное преимущество. Механическое и ферментативное расщепление приводит к лучшему выходу для тканей в постменопаузе, но не оказывает негативного влияния на образцы в пременопаузе. Мы признаем несколько ограничений нашего протокола.
Доступ к ткани влагалища человека может быть затруднен в ситуациях, когда операция по удалению вагинального пролапса не проводится, а необходимость забора клеточных суспензий из нескольких образцов биопсии ткани также может быть ограничением. Этот протокол для требования вагинальных фибробластов человека станет полезным инструментом для будущих исследований заболеваний тазового дна, особенно у лиц в постменопаузе, а также важным дополнением к исследованиям в области женского здоровья.
