Öncelikle kadın cinsiyetindeki insanları etkileyen bozukluklara yönelik araştırmalar yeterince çalışılmamakta ve yeterince finanse edilmemektedir. Pelvik organ prolapsusu, kadın cinsiyeti ile güçlü bir şekilde ilişkili bir hastalıktır. Kaslar ve bağlar zayıfladığında ve pelvik organların pelviste daha aşağıya düşmesine neden olarak vajinada bir çıkıntı oluşturduğunda ortaya çıkar.
Bu patofizyoloji bağlamında hücresel etkileşimler veya doku seviyesi faktörlerinin cerrahi girişimlerin başarısını nasıl etkilediği hakkında çok az şey bilinmektedir. Primer fibroblastların insan vajinasından izolasyonu, pelvik organ prolapsusunun altında yatan biyolojik mekanizmaları incelemek için yararlı olabilir. Pelvik organ prolapsusu genellikle yaşlı veya menopoz sonrası bireyleri etkiler.
Primer fibroblastların izolasyonu ve proliferasyonu, bu durumun incelenmesi, azalmış hücre popülasyonları ve yaşlı donörlerin klonojenik yetenekleri nedeniyle zordur. İnsan vajinal örneklerini kullanan çoğu makale, pelvik organ prolapsusu olan premenopozal bireylerden alınan dokuyu kullanır. Birkaç makale hem premenopozal hem de postmenopozal bireylerden alınan örneklerin kullanıldığını bildirmiş olsa da, fibroblastı yaşlı veya postmenopozal donörlerden başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılan protokolü yeterince ayrıntılı olarak tanımlamamıştır.
Menopoz sonrası dokudan fibroblastlar kullanılarak yapılan izolasyon ve hastalık modellemesi, pelvik organ prolapsusunun hücresel patofizyolojisini anlamak için gerekli olabilir, çünkü bu durum menopozu takip eden on yıl içinde bireylerde en yüksek prevalansa sahiptir, Mekanik ve enzimatik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullanarak insan vajinal dokusundan fibroblastla zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyonun izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu makale, menopoz sonrası veya yaşlanan insan vajinal fibroblastlarının nasıl elde edileceğine dair güvenilir bir protokolü açıklamaktadır. Alınan dokular protokolü doğrulamak için histolojik olarak analiz edildi.
Dokuyu yaklaşık bir santimetre kare boyutunda ölçün ve kesin. Biyopsi boyutunun hassas bir şekilde ölçüldüğünden emin olun. Tek bir donörden her biri bir santimetre kare olan iki ila üç ek vajinal biyopsi hazırlayın ve biyopsileri bir kenara koyun.
Vajinal biyopsiyi bir hücre kültürü Petri kabına yerleştirdikten sonra, iki steril neşter kullanarak vajinal dokuyu küçük parçalara ayırın. Bıçakların uçlarının doku yüzeyine dik olduğundan emin olun. İki neşter kullanarak doku yüzeyine eşit ve sabit bir basınç uygulayın.
Dokuları çok küçük parçalara ayırmak için alternatif bir çekme hareketi gerçekleştirin. Bu kıyma tekniğini, iki neşter kullanarak, numune bir ila iki milimetrelik parçalarla eşit kıvamda olana kadar tekrarlayın. Kıyılmış dokuyu süspanse ederek plakaya iki ila üç mililitre serumsuz hücre kültürü ortamı ekleyin.
Herhangi bir topaklanmayı parçalamak için doku parçaları içeren çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin. Doku parçaları içeren çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Toplam hacim 10 mililitre olana kadar ilave serumsuz hücre kültürü ortamı ekleyin.
Liberaz'ı kullanım için 230 mikrolitrelik alikotlarda saklayın. Tüpe 230 mikrolitre Liberace ekleyin. Tüpleri, bir numune karıştırıcı kullanarak sürekli kuvvetli çalkalama ile 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.
Sürekli ajitasyon sürdürün. Kuluçka sırasında tüpleri 30 dakikalık aralıklarla vorteksleyin. Numuneleri beş dakika santrifüjleyin 3000 G'de. Süpernatanı çıkarın ve atın.
Liberaz'ı seyreltmek için peleti% 10 fetal sığır serumu ile bir ila iki mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden süspanse olana kadar kuvvetlice pipetleyin. Çözeltiyi hücre süzgeci üzerine nazikçe pipetleyerek doku enzimi süspansiyonunu süzün.
Aynı donörün birden fazla doku biyopsisinden hücre süspansiyonlarını birlikte çekin. Steril beş mililitrelik bir şırınganın pistonuyla, süzgecin üzerine doku enzim süspansiyonunu bastırın. Kalan doku parçaları tamamen bastırılmış gibi görünene kadar bu adımı tekrarlayın.
Plaka, tek bir Petri kabında aynı donörden alınan birden fazla vajinal biyopsiden hücre süspansiyonu çekti. 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreleri bir faz kontrast mikroskobu ile gözlemleyin. Mikroskobun plakanın altına odaklandığından emin olun.
Az sayıda fibroblast tabana bağlanacaktır. İşte protokolün temel adımları vurgulayan şematik bir temsili. Şekil iki, sıfırıncı günde asılı hücrelerin faz kontrast görüntüsünü göstermektedir.
Şekil üç, kültürün 14. gününde üç adet bir santimetre kare doku biyopsisinden çekilen bir süspansiyondan 100X büyütmede vajinal primer fibroblastların bir faz kontrast görüntüsüdür. Tablo bir, bu mevcut çalışmada vajinal fibroblast izolasyonunu denemek için diğer protokollerin kullanılmasından elde edilen sonuçları göstermektedir. Fibroblastlar, mentonun pozitif boyanması ile tanımlandı.
Burada gösterilen premenopozal ve postmenopozal vajinal dokularda immünofloresan analizi yapıldı. Görüntüler 200X büyütme ile çekilmiştir. İzole fibroblastlar ayrıca premenopozal ve postmenopozal doku örneklerinde alfa düz kas aktini ve F aktin ile boyandı.
Yaşlı donörlerde vajinal mukozadan primer fibroblastların izolasyonu için optimize edilmiş ve güvenilir bir protokol geliştirdik. Primer hücrelerin ayrışması için hayvan ve insan dokusu için daha önce yayınlanmış protokollerin kullanılması, bu çalışmada insan vajinal örneklerinden herhangi bir fibroblast çıkarmayı başaramadı. İnsan vajinal dokusundan hücre ayrışmasının zorluklarının iki olası nedenini varsayıyoruz.
Mukozanın dermal kalınlığı yaşlı donörlerde ve mukozal olmayan dokuya kıyasla daha fazladır ve fibroblast yoğunluğu yaşlı bireylerde belirgin şekilde azalabilir. Birkaç kritik adım değiştirilmemelidir. İki neşter tekniği kullanılarak çok titiz bir mekanik sindirimin uygulanması ve tek bir donörün üç ila dört tam kalınlıkta biyopsisinin hücre süspansiyonlarının bir araya getirilmesi.
Protokolümüzün belirgin bir avantajı var. Mekanik ve enzimatik sindirim, menopoz sonrası doku için daha iyi verime yol açar, ancak menopoz öncesi örnekler üzerinde olumsuz bir etkisi yoktur. Protokolümüzde çeşitli sınırlamalar olduğunu kabul ediyoruz.
Vajinal prolapsus cerrahisinin yapılmadığı durumlarda insan vajinal dokusuna erişim zor olabilir ve çoklu doku biyopsi örneklerinin hücre süspansiyonlarının çekilmesi ihtiyacı da bir sınırlama olabilir. İnsan vajinal fibroblastlarını gerektiren bu protokol, özellikle menopoz sonrası bireylerde pelvik taban bozukluklarında gelecekteki araştırmalar için yararlı bir araç olacak ve aynı zamanda kadın sağlığı araştırmalarına önemli bir katkı sağlayacaktır.
