주로 여성에게 영향을 미치는 장애에 대한 연구는 연구가 부족하고 자금이 부족합니다. 골반 장기 탈출증은 여성의 성별과 밀접한 관련이 있는 질환입니다. 근육과 인대가 약해지고 골반 장기가 골반 아래쪽으로 떨어지면서 질이 부풀어 오를 때 발생합니다.
이 병태생리학의 맥락에서 세포 상호 작용에 대해 알려진 바는 거의 없으며, 조직 수준 요인이 외과적 중재의 성공에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 인간의 질에서 원발성 섬유아세포를 분리하는 것은 골반 장기 탈출증의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 골반 장기 탈출증은 일반적으로 노인이나 폐경 후에 발생합니다.
이 질환에 대한 원발성 섬유아세포의 분리 및 증식 연구는 세포 개체수 감소와 고령 기증자의 클론 생성 능력으로 인해 어렵습니다. 인간의 질 샘플을 사용하는 대부분의 논문은 골반 장기 탈출증이 있는 폐경 전 개인의 조직을 사용합니다. 몇몇 논문에서 폐경 전과 폐경 후 모두의 샘플을 사용했다고 보고했지만, 고령 또는 폐경 후 기증자로부터 섬유아세포를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 충분히 자세히 설명하지 않았습니다.
폐경 후 조직에서 섬유아세포를 사용한 분리 및 질병 모델링은 골반 장기 탈출증의 세포 병태생리를 이해하는 데 필수적일 수 있으며, 이 상태는 폐경 후 10년 동안 개인에서 가장 높은 유병률을 보이기 때문에 기계적 및 효소적 해리의 조합을 사용하여 인간 질 조직에서 섬유아세포가 풍부한 단세포 현탁액을 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 기사는 폐경 후 또는 노화하는 인간 질 섬유아세포를 획득하는 방법에 대한 신뢰할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다. 채취된 조직을 조직학적으로 분석하여 프로토콜을 검증했습니다.
조직을 측정하고 약 1cm 제곱의 크기로 자릅니다. 생검 크기의 정확한 측정을 보장합니다. 한 명의 기증자로부터 각각 1cm의 제곱을 측정하여 2-3개의 추가 질 생검을 준비하고 생검을 따로 보관합니다.
세포 배양 페트리 접시에 질 생검을 넣은 후 두 개의 멸균 메스를 사용하여 질 조직을 작은 조각으로 다집니다. 칼날의 끝이 조직 표면과 수직이 되도록 합니다. 두 개의 메스를 사용하여 조직 표면에 균일하고 일정한 압력을 가합니다.
조직을 아주 작은 조각으로 자르기 위해 번갈아 당기는 동작을 수행합니다. 샘플이 1-2mm 조각으로 균일한 일관성이 될 때까지 두 개의 메스를 사용하여 이 다지기 기술을 반복합니다. 2-3 밀리리터의 무혈청 세포 배양 배지를 플레이트에 넣고 다진 조직을 부유시킵니다.
조직 조각이 들어있는 용액을 피펫팅하여 덩어리를 분해합니다. 조직 조각이 포함된 용액을 15밀리리터의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 총 부피가 10mL가 될 때까지 무혈청 세포 배양 배지를 추가합니다.
Literase를 230 마이크로리터 부분 표본으로 보관하여 사용하십시오. 튜브에 230 마이크로 리터의 Liberace를 첨가하십시오. 샘플 믹서를 사용하여 섭씨 37도에서 지속적으로 격렬한 교반으로 3시간 동안 튜브를 배양합니다.
끊임없는 교반을 유지하십시오. 배양 중에 30분 간격으로 튜브를 소용돌이치게 합니다. 3000G에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 상층액을 제거하고 버립니다.
Liberase를 희석하기 위해 10 % 태아 소 혈청과 함께 1-2 밀리리터의 세포 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 펠릿이 완전히 다시 부유될 때까지 세게 피펫팅합니다. 세포 여과기 위에 용액을 부드럽게 피펫팅하여 조직 효소 현탁액을 걸러냅니다.
동일한 기증자의 여러 조직 생검에서 세포 현탁액을 함께 추출합니다. 멸균 5밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 여과기 위의 조직 효소 현탁액을 통해 누릅니다. 나머지 조직 조각이 완전히 눌린 것처럼 보일 때까지 이 단계를 반복합니다.
Plate는 단일 Petri 접시에서 동일한 기증자의 여러 질 생검에서 세포 현탁액을 추출했습니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 배양한 후 위상차 현미경으로 세포를 관찰합니다. 플레이트 바닥에 현미경의 초점을 맞춥니다.
소수의 섬유 아세포가 바닥에 부착됩니다. 다음은 프로토콜의 다이어그램 표현으로, 주요 단계를 강조합니다. 그림 2는 0일째에 부유 세포의 위상차 이미지를 보여줍니다.
그림 3은 1cm 제곱 조직 생검 3회의 당겨진 현탁액에서 100X 배율로 배양 14일째에 질 원발성 섬유아세포의 위상차 이미지입니다. 표 1은 본 연구에서 질 섬유아세포 분리를 시도하기 위해 다른 프로토콜을 사용한 결과를 보여줍니다. 섬유아세포는 망통의 양성 염색에 의해 확인되었습니다.
면역형광 분석은 여기에 표시된 폐경 전 및 폐경 후 질 조직에 대해 수행되었습니다. 이미지는 200X 배율로 촬영되었습니다. 분리된 섬유아세포는 또한 폐경 전 및 폐경 후 조직 샘플에서 알파 평활근 액틴 및 F 액틴으로 염색되었습니다.
우리는 고령 기증자의 질 점막에서 원발성 섬유아세포를 분리하기 위한 최적화되고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 이 연구에서 일차 세포의 해리를 위해 동물 및 인간 조직에 대해 이전에 발표된 프로토콜을 사용하여 인간 질 샘플에서 섬유아세포를 추출하지 못했습니다. 우리는 인간의 질 조직에서 세포가 분리되는 문제에 대한 두 가지 가능한 이유에 대한 가설을 세웠습니다.
점막의 피부 두께는 고령 기증자에서 더 크며 비점막 조직과 비교할 때 밀도 섬유아세포는 고령 개인에서 현저하게 감소할 수 있습니다. 몇 가지 중요한 단계는 수정해서는 안 됩니다. 두 개의 메스 기술을 사용하여 매우 엄격한 기계적 소화를 구현하고 단일 기증자의 3-4 개의 전체 두께 생검의 세포 현탁액을 함께 가져옵니다.
우리의 프로토콜에는 뚜렷한 장점이 있습니다. 기계적 및 효소적 분해는 폐경 후 조직의 수율을 향상시키지만 폐경 전 샘플에 부정적인 영향을 미치지는 않습니다. 우리는 프로토콜에 대한 몇 가지 제한 사항을 인정합니다.
질 탈출증 수술이 수행되지 않는 상황에서는 인간 질 조직에 접근하는 것이 어려울 수 있으며, 여러 조직 생검 샘플의 세포 현탁액을 당겨야 하는 필요성도 제한될 수 있습니다. 인간 질 섬유아세포를 필요로 하는 이 프로토콜은 골반저 질환, 특히 폐경 후 개인에 대한 향후 연구에 유용한 도구가 될 뿐만 아니라 여성 건강 연구에 중요한 추가 사항이 될 것입니다.
