La investigación sobre los trastornos que afectan principalmente a las personas de género femenino está poco estudiada y poco financiada. El prolapso de órganos pélvicos es el trastorno fuertemente asociado con el sexo femenino. Ocurre cuando los músculos y ligamentos se debilitan y hacen que los órganos pélvicos caigan más abajo en la pelvis, creando una protuberancia en la vagina.
Se sabe poco sobre las interacciones celulares en el contexto de esta fisiopatología, ni sobre cómo los factores a nivel tisular influyen en el éxito de las intervenciones quirúrgicas. El aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana puede ser útil para estudiar los mecanismos biológicos subyacentes al prolapso de órganos pélvicos. El prolapso de órganos pélvicos suele afectar a personas mayores o posmenopáusicas.
El estudio del aislamiento y la proliferación de fibroblastos primarios de esta enfermedad es un desafío debido a la reducción de las poblaciones celulares y la capacidad clonogénica de los donantes mayores. La mayoría de los trabajos que utilizan muestras vaginales humanas utilizan tejido de personas premenopáusicas con prolapso de órganos pélvicos. Aunque algunos artículos informaron el uso de muestras de individuos premenopáusicos y posmenopáusicos, no describieron con suficiente detalle el protocolo utilizado para aislar con éxito fibroblastos de donantes mayores o posmenopáusicos.
El aislamiento y el modelado de la enfermedad utilizando fibroblastos de tejido postmenopáusico pueden ser esenciales para comprender la fisiopatología celular del prolapso de órganos pélvicos, ya que esta afección tiene la mayor prevalencia en individuos en la década posterior a la menopausia. Describimos un método para el aislamiento y cultivo de una suspensión unicelular enriquecida con fibroblastos a partir de tejido vaginal humano utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática. Este artículo describe un protocolo confiable sobre cómo adquirir fibroblastos vaginales humanos posmenopáusicos o envejecidos. Los tejidos recolectados se analizaron histológicamente para validar el protocolo.
Mide y corta el tejido hasta que tenga un tamaño aproximado de un centímetro cuadrado. Asegurar una medición precisa del tamaño de la biopsia. Prepare dos o tres biopsias vaginales adicionales, de un centímetro cuadrado cada una, de un solo donante, y deje las biopsias a un lado.
Después de colocar la biopsia vaginal en una placa de Petri de cultivo celular, pique el tejido vaginal en fragmentos pequeños, utilizando dos bisturíes estériles. Asegúrese de que las puntas de las cuchillas estén perpendiculares a la superficie del tejido. Aplique una presión igual y constante sobre la superficie del tejido, utilizando dos bisturíes.
Realice una acción de tracción alterna para cortar los tejidos en trozos muy pequeños. Repita esta técnica de picado, con dos bisturís, hasta que la muestra tenga una consistencia uniforme con trozos de uno a dos milímetros. Agregue de dos a tres mililitros de medios de cultivo celular sin suero a la placa, suspendiendo el tejido picado.
Pipetea la solución que contiene fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos. Transfiera la solución que contiene fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue medios de cultivo celular adicionales sin suero hasta que el volumen total sea de 10 mililitros.
Almacene Liberase en alícuotas de 230 microlitros para su uso. Añade 230 microlitros de Liberace al tubo. Incubar los tubos durante tres horas a 37 grados centígrados con agitación constante y vigorosa, utilizando un mezclador de muestras.
Mantener una agitación constante. Agite los tubos a intervalos de 30 minutos durante la incubación. Centrifugar las muestras durante cinco minutos A 3000 G. Retirar y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en uno o dos mililitros de medio de cultivo celular con un 10% de suero bovino fetal para diluir la Liberase. Pipetear enérgicamente hasta que el pellet se vuelva a suspender por completo. Cuele la suspensión de enzimas tisulares pipeteando suavemente la solución sobre el filtro de células.
Extraiga suspensiones celulares de múltiples biopsias de tejido del mismo donante. Con el émbolo de una jeringa estéril de cinco mililitros, presione a través de la suspensión de enzimas tisulares sobre el colador. Repita este paso hasta que los fragmentos de tejido restantes parezcan estar completamente presionados.
Placa extraída de suspensión celular de múltiples biopsias vaginales del mismo donante en una sola placa de Petri. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados, observe las células con un microscopio de contraste de fase. Asegúrese de enfocar el microscopio en la parte inferior de la placa.
Un pequeño número de fibroblastos se unirá a la parte inferior. A continuación, se muestra una representación esquemática del protocolo, destacando los pasos clave. La figura dos muestra una imagen de contraste de fase de las células suspendidas en el día cero.
La figura tres es una imagen de contraste de fase de fibroblastos primarios vaginales en el día 14 de cultivo con un aumento de 100X a partir de una suspensión estirada de tres biopsias de tejido de un centímetro cuadrado. En la Tabla uno se muestran los resultados del uso de otros protocolos para intentar el aislamiento de fibroblastos vaginales en este estudio. Los fibroblastos se identificaron mediante tinción positiva del mentón.
El análisis de inmunofluorescencia se realizó en los tejidos vaginales premenopáusicos y posmenopáusicos que se muestran aquí. Las imágenes se tomaron con un aumento de 200X. Los fibroblastos aislados también se tiñeron con actina de músculo liso alfa y actina F en muestras de tejido premenopáusico y posmenopáusico.
Desarrollamos un protocolo optimizado y fiable para el aislamiento de fibroblastos primarios de la mucosa vaginal en donantes mayores. El uso de protocolos previamente publicados para tejido animal y humano para la disociación de células primarias no logró extraer ningún fibroblasto de muestras vaginales humanas en este estudio. Planteamos la hipótesis de dos razones probables para los desafíos de la disociación celular del tejido vaginal humano.
El grosor dérmico de la mucosa es mayor en los donantes de edad avanzada y, en comparación con el del tejido no mucoso, la densidad de los fibroblastos puede reducirse notablemente en los individuos de edad avanzada. Algunos pasos críticos no deben modificarse. La implementación de una digestión mecánica muy rigurosa, utilizando la técnica de dos bisturíes, y juntando las suspensiones celulares de tres a cuatro biopsias de espesor completo de un solo donante.
Nuestro protocolo tiene una clara ventaja. La digestión mecánica y enzimática conduce a mejores rendimientos para el tejido postmenopáusico, pero no tiene un impacto negativo en las muestras premenopáusicas. Reconocemos varias limitaciones de nuestro protocolo.
El acceso al tejido vaginal humano puede ser un desafío en situaciones en las que no se realiza una cirugía de prolapso vaginal, y la necesidad de extraer suspensiones celulares de múltiples muestras de biopsia de tejido también puede ser una limitación. Este protocolo para la requerimiento de fibroblastos vaginales humanos será una herramienta útil para futuras investigaciones sobre los trastornos del suelo pélvico, especialmente en individuos posmenopáusicos, así como una adición importante a la investigación de la salud de la mujer.
