Образование прокоагулянтов тромбоцитов имеет решающее значение для поддержания гемостаза. Этот процесс включает в себя экспрессию фосфолипидов и высвобождение микровезикул на поверхности тромбоцитов, что имеет важное значение для этапов коагуляции. Оценка этого процесса позволила получить новые данные о том, как прокоагулянтные реакции тромбоцитов прокоагулянтируют при различных заболеваниях человека.
Проточная цитометрия является краеугольным камнем и получила широкое признание при оценке экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах и высвобождении микровезикул. Выделение и анализ очищенных тромбоцитов из крови занимает много времени и требует специализированного лабораторного оборудования, поэтому в настоящее время они недоступны для рутинной клинической диагностики. Анализ воздействия фосфатидилсерина и высвобождения микровезикул также является сложной задачей из-за их небольшого размера и небольшого числа положительных событий для маркеров, представляющих интерес.
Для начала соберите периферическую венозную кровь в пробирки для сбора, содержащие активный антикоагулянт тринатрия цитрат с лимонной кислотой и декстрозой. Аккуратно переверните пробирку, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом, и дайте смеси отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут. Подсчитайте количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика клеток, чтобы определить правильную скорость центрифугирования.
Чтобы приготовить обогащенную тромбоцитами плазму, центрифугируйте кровь при 250 г в течение 10 минут при комнатной температуре, не применяя перерыв. Затем добавьте 1 миллилитр ACDA и 6,25 микролитра апиразы к 9 миллилитрам обогащенной тромбоцитами плазмы. Центрифугируйте смесь при температуре 1, 100 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
С помощью пипетки Pasture удалите надосадочную жидкость, содержащую бедную тромбоцитами плазму, и осторожно повторно суспендируйте тромбоцитарную гранулу в 1 миллилитре промывочного буфера. Затем добавьте в пробирку от 3 до 4 миллилитров промывочного буфера и снова центрифугируйте ее. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр моющего буфера.
Перенесите 150 микролитров взвеси тромбоцитов в 1,5-миллилитровую пробирку для подсчета клеток в автоматизированном счетчике клеток. Добавьте от 3 до 4 миллилитров буфера для стирки в оставшуюся суспензию, чтобы выполнить дополнительную стирку, как было показано ранее. Затем повторно суспендируйте тромбоцитарную гранулу в реакционном буфере для достижения конечной концентрации 5 x 10 в степени 11 тромбоцитов на литр.
Для начала получите отмытые тромбоциты в нужном буфере для проточной цитометрии. Подготовьте все агонисты и флуорохромы в реакционном буфере. Для внутренних анализов добавьте 100 микролитров промытых тромбоцитов в концентрации 50 х 10 в степени 9 тромбоцитов на литр в разные пробирки для обработки.
Аккуратно встряхните каждую аликвоту и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут. Затем добавьте в каждую микропробирку по 5 микролитров неразведенного Аннексина V-FITC и инкубируйте. После этого добавьте 500 микролитров реакционного буфера в каждую пробирку, чтобы остановить процесс.
Затворите популяцию тромбоцитов с помощью прямого рассеяния или FSC и используйте графики плотности для независимой идентификации каждой популяции. Установите отрицательный порог в крайнем правом углу популяции тромбоцитов в состоянии покоя. После активации классифицируйте события справа от этого порога как тромбоциты, экспонирующие фосфатидилсерин.
Для дифференцировки микровезикул установите пороговое значение на самом низком значении FSC, наблюдаемом в популяции тромбоцитов в состоянии покоя. После активации классифицируйте положительные события с фосфатидилсерином ниже этого порога как микровезикулы. Исходные измерения показали, что менее 2,9% неактивированных тромбоцитов демонстрировали воздействие фосфатидилсерина.
После активации 26,7% тромбоцитов стали фосфатидилсерин-положительными с коллагеном, 9,1% с тромбином и 36,2% с коллагеном и тромбином. Лечение ионофорами привело к получению 49,6% фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов. Исходная доля микровезикул составила 0,3%Достоверное увеличение наблюдалось только при совместном использовании коллагена и тромбина на уровне около 11,4% и в большей степени при использовании ионофоров на уровне 44%
