Тромбоциты должны быть свободны от клеток крови и белков при изучении их биохимических и физиологических свойств. Поэтому мы разработали протокол для очистки тромбоцитов от крови мыши. Этот метод может очищать тромбоциты с помощью иохэксола градиента средней и низкой скорости центрифугации, что приводит к четкому отделению тромбоцитов от других компонентов крови.
Для очистки тромбоцитов, используйте широкое отверстие пипетки наконечник слоя 200 микролитров свежесобранной цельной крови медленно вниз стороне 1,5-миллилитровой трубки на 600 микролитров иохекзола градиента среды без смешивания. После центрифугации в размахивая ведро ротора, чтобы изолировать тромбоциты, использовать новый широкоствой пипетки отзыв для сбора большей части тромбоцитов богатых слой и небольшая часть тромбоцитов бедных слой без аспирации белых кровяных клеток или слоя красных кровяных телец. Добавьте образец тромбоцитов в новую трубку и добавьте в тромбоциты один миллилитр PBS.
Смешайте тромбоциты инверсией перед выполнением другой центрифугации. Затем повторно посовесить гранулы в 200 микролитров PBS с мягкой пипетки. Для активации тромбоцитов перенесите один-два раза 10 на шесть тромбоцитов в новую трубку, содержащую 100 микролитров буфера окрашивания.
Добавьте один-два раза по 10 к шести тромбоцитам в другую трубку, содержащую 100 микролитров окрашивания буфера, дополненного пептидом GPRP 0,4 миллимолара. Добавьте тромбин в трубку пептидом GPRP, чтобы активировать тромбоциты, и добавьте коктейль антител, представляющий интерес для обеих трубок. В качестве положительного контроля добавьте один микролитр цельной крови в до 100 микролитров буфера окрашивания в трубку, содержащую пептид GPRP 0,4 миллимоля, и добавьте тромбин для активации этих тромбоцитов.
В качестве отрицательного контроля добавьте один микролитер всей крови в до 100 микролитров буфера окрашивания. Затем испачкать обе контрольные трубки с антителом коктейль. После 30 минут при комнатной температуре в темноте, мыть образцы с одним миллилитр свежего буфера окрашивания на трубку.
Повторное производство гранул в 300 микролитров свежего буфера окрашивания. Затем перенесите образцы клеток в отдельные трубы цитометрии потока, защищенные от света. Чтобы проанализировать тромбоциты по цитометрии потока, создайте новый эксперимент и создайте логаритмическое рассеяние вперед по сравнению с логаритмическими участками точек рассеяния.
После регулировки напряжения по мере необходимости, завемить одноцветные окрашенные клетки для контроля компенсации. Теперь запустите положительный контрольный образец, чтобы получить достаточно ячеек, чтобы настроить компенсацию и ворота. Затем приобретайте и записывая 100 000 событий для каждого образца крови, и анализируйте данные цитометрии потока, используя соответствующие участки и ворота.
Если кровь добавляется на среду медленно, иохексол градиент среды и образец крови будет образовывать два отдельных слоя в трубке. После центрифугации верхний слой соломенного цвета содержит плазму, но не содержит нетронутых кровяных телец. Второй, беловатый, богатый тромбоцитами слой содержит большинство тромбоцитов.
Третий, прозрачный слой является тромбоцитов бедных слой и непосредственно над красными кровяными клетками и белыми кровяными клетками гранулы. Целая кровь экспонатов различных популяций красных кровяных телец, белых кровяных телец и тромбоцитов на логаритмических вперед рассеяния по сравнению с боковой рассеяния точка участка. Очищенные тромбоциты, однако, демонстрируют различные популяции с незначительным количеством красных или белых кровяных телец.
Целые образцы крови содержат Ter119-положительные красные кровяные клетки и CD45-положительные популяции белых кровяных телец, которые почти отсутствуют в очищенных образцах тромбоцитов. Необработанные очищенные тромбоциты почти не выражают маркеров активации, подтверждающих их состояние покоя, в то время как очищенные тромбоциты, обработанные тромбоцитами, обычно демонстрируют экспрессию 71% P-селетина. Микроскопическая оценка необработанных очищенных образцов тромбоцитов не выявила агрегации тромбоцитов.
После активации с тромбином, однако, тромбоциты демонстрируют надежную агрегацию, еще больше подтверждая их жизнеспособность после очистки, как попродемонстрировано. Слой образца крови тщательно на iohexol среды, и при сборе тромбоцитов, не забудьте аспирировать тщательно, чтобы не собирать красные кровяные клетки и белые слои клеток крови для успешного очищения тромбоцитов. Этот метод может быть использован для очистки тромбоцитов от других видов, а также.
Очищенные тромбоциты могут быть использованы для экспрессии генов, активации, агрегации, высвобождения гранул и исследований адгезии.
