Наше исследование сосредоточено на динамике каталитических активных РНК и на том, как эта динамика изменяется в различных условиях окружающей среды. Мы используем одномолекулярный FRET для изучения влияния таких факторов, как моновалентные и двухвалентные средние линии, шапероновые белки и агенты скученности на динамику РНК. Точное включение донорных и акцепторных флуорофоров без нарушения структуры и функции РНК является сложной задачей.
Кроме того, трудно отследить сворачивание большой динамической РНК. Тем не менее, установленный протокол маркировки и инкапсуляции позволяет нам отслеживать динамику сворачивания функциональной РНК с течением времени. Наш протокол решает задачу наблюдения за большими, каталитически активными РНК в режиме реального времени и в неофизиологических условиях.
Путем ковалентного мечения и инкапсуляции РНК и везикул, которые затем иммобилизуются на поверхности, мы можем контролировать функцию РНК с помощью одномолекулярного TIRF. Мы специализируемся на ковалентном мечении FRET длинных каталитических РНК и, в частности, интронов группы II. Это сложная задача из-за их структурной сложности.
При инкапсуляции в везикулы мы удерживаем РНК в пределах исчезающего поля для микроскопии TIRF, и при этом РНК может свободно плавать. Таким образом, smFRET может беспрепятственно раскрывать динамическое поведение РНК. Мы продолжим попытки понять, как на самом деле работает природа, сосредоточившись на структурно-функциональных отношениях и динамике рибосом, рибопереключателей и других регуляторных РНК, используя мультиметодический подход.
Таким образом, переход к исследованиям в физиологических и клеточных условиях будет основным направлением нашей работы в будущем. Для начала выделите интересующую вас РНК, содержащую от 50 до 75 микрограммов РНК на пробирку в 55 микролитрах воды двойной дистилляции, затем добавьте к РНК 45 микролитров смеси ацетата натрия pH 6 от EDC/NHS. Инкубируйте смесь в течение четырех часов при температуре 25 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 500 об/мин.
После инкубации ресуспендировать активированную РНК-гранулу в 95 микролитрах 100-миллимолярного буфера MOPS pH 7,5. Затем добавьте пять микролитров двухмиллимолярного сульфированного цианина-3 амина к активированной РНК и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение 16 часов при 500 оборотах в минуту, чтобы соединить флуорофор с активированным 5-первичным фосфатом. На следующий день добавьте 200 микролитров дважды дистиллированной воды для улучшения сепарации.
Затем очистите РНК, меченную 5-первичным фосфатом, путем осаждения этанола. После очистки суспендируйте меченую РНК в 100 микролитрах 100-миллимолярного триса HCl и инкубируйте в течение двух часов при температуре 25 градусов Цельсия. Затем, чтобы удалить свободные красители, промойте меченую РНК в воде двойной дистилляции с центробежной фильтрацией.
Для мечения с двойным концом аликвотируйте 5-простую меченую концевую РНК, содержащую примерно от 50 до 75 микрограммов РНК на пробирку в 90 микролитрах раствора. Добавьте пять микролитров одномолярного буфера ацетата натрия pH 5,5. Затем добавьте четыре микролитра свежеприготовленного 500-миллимолярного исходного раствора метапериодата натрия.
Для одиночной маркировки 3-prime добавьте восемь микролитров исходного раствора метапериодата. После инкубации растворов в темноте в течение двух часов пипеткой нанесите 30 микролитров 50%-ного глицерина, чтобы остановить реакцию. После 30 минут инкубации добавьте 400 микролитров ледяной смеси этанола ацетата натрия для осаждения.
Ресуспендируйте окисленную РНК-гранулу в 95 микролитрах 50-миллимолярного буфера ацетата натрия pH шесть. Очистите меченую с двумя концами РНК с помощью осаждения этанола и центробежной фильтрации, как было показано ранее. Разбавьте очищенную РНК в воде двойной дистилляции.
Визуально сравнивайте цвета надосадочной жидкости и гранул, полученные после каждого этапа. Рассчитайте концентрацию РНК и конъюгированного красителя на спектрофотометре в УФ-видимом диапазоне. Флуоресцентный гель-электрофорез подтвердил успешное одинарное и двойное мечение РНК, о чем свидетельствует комиграция РНК с флуорофорами.
Эффективность FRET повышалась в присутствии ионов металлов, что свидетельствовало о сворачивании РНК, что приводило к снижению донорной эмиссии и увеличению акцепторной эмиссии. Чтобы подготовить микрофлюидную камеру, используйте алмазный буровой станок, чтобы просверлить четыре отверстия в кварцевых предметных стеклах, чтобы сформировать два канала. Поместите просверленные кварцевые предметные стекла и примерно в два раза больше покровных стекол в стеклянную банку для окрашивания Coplin с крышкой.
Обработайте слайды и покровные стекла ультразвуком в воде двойной дистилляции в течение пяти минут. Далее обработайте банку ультразвуком в 10%-ном растворе для чистки лабораторной посуды в течение 30 минут при температуре 50 градусов Цельсия. После промывки банки дважды дистиллированной водой, обработать ультразвуком в одномолярном растворе гидроксида калия на 30 минут и оставить в растворе на ночь.
После многократного промывки и ультразвуковой обработки дистиллированной водой высушите слайды и покровные стекла с помощью потока газообразного азота. Обработайте высохшие предметные стекла и покровные стекла кислородным плазменным очистителем в течение 30 минут. Поместите чистые предметные стекла и покровные стекла в банку для окрашивания Coplin, содержащую 3%-ный раствор этанола Sonicate из теста AP, на одну минуту, а затем инкубируйте в течение 30 минут.
Промойте стекла и покровные стекла три раза абсолютным этанолом и водой двойной дистилляции, затем высушите их под потоком газообразного азота. Затем подготовьте влажную коробку, заполнив пустую коробку с наконечником для пипетки наполовину водой двойной дистилляции. Поместите предметные стекла внутрь коробки стороной для обработки вверх.
Добавьте 30 микролитров свежеприготовленной смеси bPEG/mPEG в центр предметного стекла, чтобы покрыть оба канала. Накройте каплю чистым покровным стеклом и закройте влажную коробку. Инкубируйте коробку на ночь в темноте для ПЭГилирования.
На следующий день промойте ПЭГ-пассивированные и биотинилированные стекла и покровные стекла двойной дистилляцией и наблюдайте за изменением гидрофобности обработанных поверхностей. Прикрепите двустороннюю наклейку к предметному стеклу, убедившись, что наклейка закрывает интересующую область. Затем осторожно поместите покровное стекло на верхнюю часть предметного стекла, выровняв PEGилированные поверхности лицом друг к другу.
Переложите собранную камеру в 50-миллилитровую центрифужную трубку, и заполните трубку газообразным азотом. Для начала с помощью стерильной иглы проткнуть отверстие изнутри наружу в крышке стерильной чистой двухмиллилитровой трубки. Добавьте в пробирку 109 микролитров смеси bPE-DMPC.
Поместите картонный вкладыш для перегородки из коробки для хранения микропробирок в 500-миллилитровую колбу Schlenk, которая будет служить держателем для пробирок. С помощью длинного пинцета осторожно поместите пробирки, содержащие липидную смесь, в держатель пробирки. Выпарите хлороформ при низком потоке газообразного азота в течение ночи.
После получения высохшего липидного слоя заклейте трубки парапленкой, чтобы закрыть отверстия. Соберите экструдер с помощью 100-нанометровой поликарбонатной мембраны и 10-миллиметрового дренажного диска из полиэстера. Уравновесьте шприц и мембраны с помощью буфера, предотвращающего моргание.
После смешивания РНК с двусторонней мечкой с буфером, препятствующим морганию, увлажните липидный массив смесью РНК-буфера против мигания при температуре 30 градусов Цельсия. Встряхивайте в течение пяти минут при 1 400 об/мин, затем 15 минут при 700 об/мин. Центрифугируйте смесь в течение двух минут при 13 000 G, и разбавьте надосадочную жидкость 250 микролитрами буфера, препятствующего миганию.
Наполните шприц липидной суспензией РНК и выдавите 35 раз при 30 градусах Цельсия на нагревательном блоке, чтобы инкапсулировать меченую с двойным концом РНК в фосфолипидные везикулы диаметром 100 нанометров. Промойте камеру два раза 200 микролитрами стандартного буфера 5X при комнатной температуре. Заполните камеру 50 микролитрами по 20 микролитров на миллилитр раствором стрептавидина, и выдержите в течение пяти минут.
Затем промойте камеру 200 микролитрами стандартного буфера и 100 микролитрами антимигающего буфера. Добавьте 75 микролитров везикулярной суспензии и инкубируйте в течение 10 минут для иммобилизации инкапсулированной РНК на поверхности. После иммобилизации промойте камеру 200 микролитрами свежеприготовленного буфера для визуализации.
Для сбора данных установите камеру на микроскоп TIRF и получите данные smFRET с переменным лазерным возбуждением. Визуализация одной молекулы FRET с помощью микроскопии TIRF отслеживала отдельные молекулы РНК и обнаруживала изменения эффективности FRET в режиме реального времени. Динамические следы одиночных молекул показали антикоррелированные колебания между сигналами донора и акцептора, что указывает на подтверждающие изменения в РНК.
