私たちの研究は、触媒活性RNAのダイナミクスと、これらのダイナミクスが異なる環境条件下でどのように変化するかに焦点を当てています。私たちは、1分子のFRETを用いて、一価および二価の正中線、シャペロンタンパク質、クラウディング剤などの因子がRNAの動態に及ぼす影響を研究しています。RNAの構造と機能を損なうことなく、ドナーとアクセプターの蛍光色素を正確に組み込むことは困難です。
さらに、大きな動的RNAのフォールディングを追跡することは困難です。しかし、確立された標識およびカプセル化プロトコルにより、機能的なRNAのフォールディングダイナミクスを経時的に監視することができます。私たちのプロトコールは、触媒活性のある大きなRNAをリアルタイムで、新生理学的条件下で観察するという課題に取り組んでいます。
RNAと小胞を共有結合的に標識してカプセル化し、表面を固定化することにより、単一分子TIRFでRNAの機能をモニターできます。私たちは、長鎖触媒RNA、特にグループIIイントロンの共有結合FRET標識に焦点を当てています。これは、その構造の複雑さによる課題です。
小胞に封入すると、TIRF顕微鏡法ではRNAをエバネッセントフィールド内に保持することができますが、それでもRNAは自由に浮かぶことができます。このように、smFRETはRNAの動的な振る舞いを支障なく明らかにすることができます。私たちは、リボソーム、リボスイッチ、およびその他の制御RNAの構造と機能の関係とダイナミクスに焦点を当てて、自然が実際にどのように機能するかをマルチテクニックアプローチで理解しようと試み続けます。
ですから、生理学的および細胞条件下での研究への移行は、今後の私たちの研究の大きな重点となるでしょう。まず、55マイクロリットルの二重蒸留水にチューブあたり50〜75マイクログラムのRNAを含む目的のRNAを分注し、次に45マイクロリットルのEDC / NHS酢酸ナトリウムpH6混合物をRNAに加えます。500 RPMで振とうしながら、25°Cで4時間インキュベートします。
インキュベーション後、活性化RNAペレットを95マイクロリットルの100ミリモルMOPS緩衝液pH7.5に再懸濁します。次に、5マイクロリットルの2ミリモルスルホン化シアニン-3アミンを活性化RNAに添加し、摂氏25度で500RPMで16時間インキュベートして、蛍光色素を活性化された5-プライムリン酸に結合させます。翌日、分離を改善するために200マイクロリットルの二重蒸留水を追加します。
次に、エタノール沈殿により、5プライムリン酸標識RNAを精製します。精製後、標識したRNAを100マイクロリットルの100ミリモルトリスHClに再懸濁し、摂氏25度で2時間インキュベートします。次に、遊離色素を除去するために、遠心ろ過により標識RNAを二重蒸留水で洗浄します。
デュアルエンド標識の場合、90マイクロリットルの溶液中にチューブあたり約50〜75マイクログラムのRNAを含む5プライム末端標識RNAを分注します。5マイクロリットルの1モル酢酸ナトリウム緩衝液pH5.5を追加します。次に、新たに調製した500ミリモルメタピオン酸ナトリウムストック溶液を4マイクロリットル加えます。
3プライムエンドシングルラベリングの場合は、8マイクロリットルのメタピリオドストック溶液を追加します。溶液を暗所で2時間インキュベートした後、50%グリセロールの30マイクロリットルをピペットで動かして反応を停止します。30分間のインキュベーション後、400マイクロリットルの氷冷エタノール酢酸ナトリウム沈殿混合物を追加します。
酸化したRNAペレットを95マイクロリットルの50ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液pH6に再懸濁します。前述したように、二重末端標識RNAをエタノール沈殿および遠心ろ過により精製します。精製したRNAを二重蒸留水で溶出します。
各ステップ後に得られる上清とペレットの色を視覚的に比較します。RNAおよびコンジュゲート色素の濃度を紫外可視分光光度計で計算します。蛍光ゲル電気泳動により、RNAと蛍光色素との共遊走によって示されるように、RNAのシングルおよびデュアル標識の成功が確認されました。
FRETの効率は金属イオンの存在下で増加し、RNAのフォールディングを示し、ドナー放出の減少とアクセプター放出の増加につながった。マイクロ流体チャンバーを準備するには、ダイヤモンドドリラーを使用してクォーツスライドに4つの穴を開け、2つのチャネルを形成します。ドリルで開けたクォーツスライドと約2倍のカバースリップを、カバー付きのガラスCoplin染色ジャーに入れます。
スライドとカバースリップを二重蒸留水で5分間超音波処理します。次に、10%実験用ガラス器具洗浄液でジャーを50°Cで30分間超音波処理します。瓶を二重蒸留水ですすいだ後、1モルの水酸化カリウム溶液で30分間超音波処理し、溶液に一晩放置します。
蒸留水によるすすぎと超音波処理を繰り返した後、窒素ガスの流れを使用してスライドとカバーガラスを乾燥させます。乾燥させたスライドとカバースリップを酸素プラズマクリーナーで30分間処理します。きれいなスライドとカバースリップを3%APテストエタノール溶液が入ったCoplin染色ジャーに入れ、1分間超音波処理し、次に30分間インキュベートします。
スライドとカバーガラスを無水エタノールと二重蒸留水でそれぞれ3回すすぎ、窒素ガスの流れで乾燥させます。次に、空のピペットチップボックスの半分に二重蒸留水を入れて、湿ったボックスを準備します。スライドをボックスの内側に置き、処理する面を上にして置きます。
30マイクロリットルの液滴を新たに調製したbPEG/mPEG混合物をスライドの中央に追加して、両方のチャネルを覆います。液滴を清潔なカバースリップで覆い、湿った箱を閉じます。PEGylationのために暗闇でボックスを一晩インキュベートします。
翌日、PEG不動態化およびビオチン化したスライドとカバースリップを二重蒸留水ですすぎ、処理された表面の疎水性の変化を観察します。両面ステッカーをスライドに貼り付け、ステッカーが関心のある領域をカバーしていることを確認します。次に、カバーガラスをスライドの上に慎重に置き、PEG化した表面を互いに向き合うように整列させます。
組み立てたチャンバーを50ミリリットルの遠心分離管に移し、窒素ガスを充填します。まず、滅菌針を使用して、滅菌された清潔な2ミリリットルのチューブの蓋に内側から外側に穴を開けます。109マイクロリットルのbPE-DMPC混合物をチューブに加えます。
マイクロチューブ収納ボックスから段ボール製のセルパーティションインサートを500ミリリットルのシュレンクフラスコに入れて、チューブホルダーとして機能します。長いピンセットを使用して、脂質混合物の入ったチューブをチューブホルダーに慎重に入れます。窒素ガスの低流量でクロロホルムを一晩蒸発させます。
乾燥脂質層を得た後、チューブをパラフィルムで密封して穴を覆います。100ナノメートルのポリカーボネートメンブレンと10ミリメートルのポリエステルドレンディスクを使用して押出機を組み立てます。シリンジとメンブレンをまばたき防止バッファーで平衡化します。
デュアルエンド標識RNAを抗まばたき緩衝液と混合した後、脂質ケーキをRNA抗まばたき緩衝液混合物で摂氏30度で水和します。1, 400 RPMで5分間振とうし、続いて700 RPMで15分間振とうします。混合物を13, 000Gで2分間遠心分離し、上清を250マイクロリットルのまばたき防止緩衝液で希釈します。
シリンジにRNA脂質懸濁液を充填し、加熱ブロック上で摂氏30度で35回押し出して、デュアルエンド標識RNAを直径100ナノメートルのリン脂質小胞にカプセル化します。室温で200マイクロリットルの5X標準バッファーでチャンバーを2回フラッシュします。チャンバーに50マイクロリットル/ミリリットルのストレプトアビジン溶液を20マイクロリットル充填し、5分間インキュベートします。
次に、200マイクロリットルの標準バッファーと100マイクロリットルの点滅防止バッファーでチャンバーを洗い流します。75マイクロリットルの小胞懸濁液を添加し、10分間インキュベートして、カプセル化されたRNAを表面に固定化します。固定化後、新たに調製したイメージングバッファー200マイクロリットルでチャンバーを洗い流します。
データ取得には、チャンバーをTIRF顕微鏡に取り付け、交互にレーザー励起してsmFRETデータを取得します。TIRF顕微鏡を用いた単一分子FRETイメージングは、個々のRNA分子を追跡し、FRET効率のリアルタイムな変化を検出しました。動的単一分子トレースは、ドナーシグナルとアクセプターシグナルの間に反相関的な揺らぎを示し、RNAの変化を確認したことを示しました。
