Nossa pesquisa se concentra na dinâmica dos RNAs ativos catalíticos e como essas dinâmicas mudam sob diferentes condições ambientais. Usamos FRET de molécula única para estudar a influência de fatores como linhas médias monovalentes e divalentes, proteínas chaperonas e agentes de aglomeração na dinâmica do RNA. Incorporar com precisão fluoróforos doadores e aceitadores sem interromper a estrutura e a função do RNA é um desafio.
Além disso, rastrear o dobramento de um grande RNA dinâmico é difícil. No entanto, o protocolo de marcação e encapsulamento estabelecido nos permite monitorar a dinâmica de dobramento do RNA funcional ao longo do tempo. Nosso protocolo aborda o desafio de observar RNAs grandes e cataliticamente ativos em tempo real e sob condições neofisiológicas.
Ao marcar e encapsular covalentemente o RNA e as vesículas, que são então imobilizadas na superfície, podemos monitorar a função do RNA com TIRF de molécula única. Nós nos concentramos na marcação covalente de FRET de RNAs catalíticos longos e, particularmente, íntrons do grupo II. Este é um desafio devido à sua complexidade estrutural.
Quando encapsulado em vesículas, conseguimos manter o RNA dentro do campo evanescente para microscopia TIRF, e ainda assim o RNA pode flutuar livremente. Desta forma, o smFRET pode revelar o comportamento dinâmico do RNA sem impedimentos. Continuaremos tentando entender como a natureza realmente funciona, concentrando-nos na relação estrutura-função e na dinâmica de ribossomos, riboswitches e outros RNAs reguladores usando uma abordagem multitécnica.
Portanto, avançar para investigações sob condições fisiológicas e celulares será uma grande ênfase de nosso trabalho no futuro. Para começar, alicote o RNA de interesse, tendo 50 a 75 microgramas de RNA por tubo em 55 microlitros de água bidestilada e, em seguida, adicione 45 microlitros da mistura de acetato de sódio EDC / NHS pH 6 ao RNA. Incube a mistura por quatro horas a 25 graus Celsius enquanto agita a 500 RPM.
Após a incubação, ressuspenda o pellet de RNA ativado em 95 microlitros de tampão MOPS de 100 milimolares pH 7,5. Em seguida, adicione cinco microlitros de cianina-3 amina sulfonada de dois milimolares ao RNA ativado e incube a 25 graus Celsius por 16 horas a 500 RPM para acoplar o fluoróforo ao fosfato 5-prime ativado. No dia seguinte, adicione 200 microlitros de água bidestilada para melhorar a separação.
Em seguida, purifique o RNA marcado com fosfato 5-prime por precipitação de etanol. Após a purificação, ressuspenda o RNA marcado em 100 microlitros de tris HCl 100 milimolares e incube por duas horas a 25 graus Celsius. Em seguida, para remover os corantes livres, lave o RNA marcado em água bidestilada com filtração centrífuga.
Para marcação de extremidade dupla, alíquota do RNA marcado com extremidade 5-prime, tendo aproximadamente 50 a 75 microgramas de RNA por tubo em 90 microlitros de solução. Adicione cinco microlitros de tampão acetato de sódio de um molar pH 5,5. Em seguida, adicione quatro microlitros de solução estoque de metaperiodato de sódio a 500 milimolares recém-preparada.
Para rotulagem simples de 3 extremidades principais, adicione oito microlitros de solução estoque de metaperiodato. Depois de incubar as soluções no escuro por duas horas, pipete 30 microlitros de glicerol a 50% para interromper a reação. Após 30 minutos de incubação, adicione 400 microlitros de mistura de precipitação de acetato de sódio com etanol gelado.
Ressuspenda o pellet de RNA oxidado em 95 microlitros de tampão acetato de sódio 50 milimolares pH seis. Purifique o RNA marcado com extremidade dupla por precipitação de etanol e filtração centrífuga, conforme demonstrado anteriormente. Eluir o RNA purificado em água bidestilada
Compare visualmente as cores do sobrenadante e do pellet obtidas após cada etapa. Calcule as concentrações de RNA e corante conjugado em um espectrofotômetro UV-visível. A eletroforese em gel fluorescente confirmou a marcação simples e dupla bem-sucedida do RNA, conforme mostrado pela comigração do RNA com os fluoróforos.
A eficiência do FRET aumentou na presença de íons metálicos, indicando dobramento de RNA, o que levou a uma diminuição na emissão de doadores e um aumento na emissão de aceptores. Para preparar uma câmara microfluídica, use um perfurador de diamante para fazer quatro furos nas lâminas de quartzo para formar dois canais. Coloque as lâminas de quartzo perfuradas e aproximadamente o dobro de lamínulas em um frasco de coloração Coplin de vidro com tampa.
Sonicar as lâminas e lamínulas em água bidestilada durante cinco minutos. Em seguida, sonice o frasco em uma solução de limpeza de vidraria de laboratório a 10% por 30 minutos a 50 graus Celsius. Depois de enxaguar o frasco com água bidestilada
Após enxágue e sonicação repetidos com água destilada, secar as lâminas e lamínulas usando o fluxo de gás nitrogênio. Trate as lâminas e lamínulas secas com um limpador de plasma de oxigênio por 30 minutos. Coloque as lâminas e lamínulas limpas em um frasco de coloração Coplin contendo solução de etanol de teste de AP a 3% Sonicate por um minuto e depois incube por 30 minutos.
Enxaguar as lâminas e lamínulas três vezes cada uma com etanol absoluto e água bidestilada e, em seguida, secá-las sob fluxo de gás azoto. Em seguida, prepare uma caixa úmida enchendo uma caixa vazia de ponta de pipeta até a metade com água bidestilada Coloque as lâminas dentro da caixa com o lado a ser tratado voltado para cima.
Adicione gotículas de 30 microlitros de mistura bPEG/mPEG recém-preparada no centro da lâmina para cobrir os dois canais. Cubra a gota com uma lamínula limpa e feche a caixa úmida. Incube a caixa durante a noite no escuro para PEGilação.
No dia seguinte, enxágue as lâminas e lamínulas passivadas com PEG e biotiniladas com água bidestilada e observe a mudança na hidrofobicidade das superfícies tratadas. Cole o adesivo de dupla face no slide, garantindo que o adesivo cubra a área de interesse. Em seguida, coloque cuidadosamente a lamínula em cima do slide, alinhando as superfícies PEGuladas uma para a outra.
Transfira a câmara montada para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e encha o tubo com gás nitrogênio. Para começar, use uma agulha estéril para fazer um furo de dentro para fora na tampa de um tubo limpo estéril de dois mililitros. Adicione 109 microlitros da mistura bPE-DMPC ao tubo.
Coloque uma inserção de divisória de célula de papelão de uma caixa de armazenamento de microtubos em um frasco Schlenk de 500 mililitros para servir como suporte de tubo. Usando uma pinça longa, coloque cuidadosamente os tubos que contêm a mistura lipídica no suporte do tubo. Evaporar o clorofórmio sob um baixo fluxo de gás nitrogênio durante a noite.
Após obter a camada lipídica seca, sele os tubos com parafilme para cobrir os orifícios. Monte a extrusora usando uma membrana de policarbonato de 100 nanômetros e um disco de drenagem de poliéster de 10 milímetros. Equilibre a seringa e as membranas com tampão anti-piscar.
Depois de misturar o RNA marcado com extremidade dupla com tampão anti-piscar, hidrate o bolo lipídico com a mistura de tampão anti-piscante de RNA a 30 graus Celsius. Agitar durante cinco minutos a 1 400 RPM, seguidos de 15 minutos a 700 RPM. Centrifugue a mistura por dois minutos a 13.000 g e dilua o sobrenadante com 250 microlitros de tampão anti-piscar.
Encha a seringa com a suspensão lipídica de RNA e extrude 35 vezes a 30 graus Celsius em um bloco de aquecimento para encapsular o RNA marcado com extremidade dupla em vesículas fosfolipídicas de 100 nanômetros de diâmetro. Lave a câmara duas vezes com 200 microlitros de tampão padrão 5X à temperatura ambiente. Encha a câmara com 50 microlitros de 20 microlitros por mililitro de solução de estreptavidina e incube por cinco minutos.
Em seguida, lave a câmara com 200 microlitros de tampão padrão e 100 microlitros de tampão anti-piscar. Adicione 75 microlitros de suspensão de vesículas e incube por 10 minutos para imobilização do RNA encapsulado na superfície. Após a imobilização, lave a câmara com 200 microlitros de tampão de imagem recém-preparado.
Para aquisição de dados, monte a câmara no microscópio TIRF e adquira dados smFRET com excitação a laser alternada. A imagem FRET de molécula única usando microscopia TIRF rastreou moléculas de RNA individuais e detectou mudanças em tempo real na eficiência do FRET. Os traços dinâmicos de molécula única mostraram flutuações anti-correlacionadas entre os sinais do doador e do aceitador, indicando mudanças de confirmação no RNA.
