Мы представляем простой протокол визуализации внутриклеточных сиалированных гликоконъюгатов с высоким пространственным разрешением, что исключает необходимость в специализированном оборудовании. Этот метод облегчает изучение биосинтеза, транспортировки и переработки в различных патологических контекстах. Чтобы добиться этого, мы сочетаем метаболическое мечение, клик-химию и экспансионную микроскопию.
Методы микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как STED и STORM, позволяют ученым преодолеть дифракционный барьер, но для этого требуется дорогостоящее оборудование. В последнее время расширительный микроскоп стал более доступной альтернативой, которая повышает разрешение за счет физического увеличения образца. Этот метод может быть использован с любыми штатными полноресурсными микроскопами.
Для этого не требуются микроскопы со сверхвысоким разрешением, которые являются дорогостоящими, трудоемкими, труднодоступными и требуют обширной оптимизации. Поэтому этот метод легко переносится в большинство лабораторий. Для начала добавьте в подготовленные клетки один миллилитр среды, дополненной 500 микромолярами N-азидоацетилманнозамина, и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%.
Затем промойте образцы одним миллилитром PBS. Используя 500 микролитров 5%-ного параформальдегида, зафиксируйте ячейки на каждом покровном листе и дайте им отдохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее подготовьте на заказ влажную камеру с помощью непрозрачного ящика с крышкой.
На дно положите влажный кусок промокательной бумаги, затем сверху постелите слой парапленки. Поместите накрытие на парапленку ячейками вверх. Для пермеабилизации клеток добавьте 200 микролитров 0,5% Triton X-100 в PBS на 15 минут при комнатной температуре.
Затем трижды промойте клетки 200 микролитрами PBS. Приготовьте реакционный буфер CuAAC для маркировки модифицированных азидом сиатилированных гликанов, сконструированных с использованием указанных компонентов. Чтобы начать реакцию, добавьте 200 микролитров буфера CuAAC в каждую покровную пластину и тщательно накройте образец.
Затем промойте крышку стекла три раза 200 микролитрами PBS, чтобы остановить реакцию и удалить излишки щупа и реагентов. Инкубируйте образцы в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в 200 микролитрах буфера-блокировки BSA. Добавьте 70 микролитров раствора, содержащего первичное антитело, в покровные листки и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте.
Затем добавьте 100 микролитров флуоресцентного вторичного антитела в каждую покровную пластину и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света. После трехкратной промывки покровных колпачков PBS переложите покровные стекла в шестилуночный планшет и храните образцы в двух миллилитрах PBS при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней в защищенном от света месте. Для начала инкубируйте клетки иммуноокрашивания н-акрилоилсукцинимидом в концентрации 3,2 мг на миллилитр в PBS на механическом шейке в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем трижды промойте образцы одним миллилитром PBS. Теперь нанесите каплю раствора мономера объемом 70 микролитров на кусок парапленки. Добавьте 1,4 микролитра 10% N, N'N'Тетраметилэтилендиамина и 10% персульфата аммония, затем смешайте их с каплей.
Быстро наденьте защитный листок на раствор ячейками вниз. Дайте раствору полимеризоваться в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере. Затем добавьте в гидрогель один миллилитр буфера для сбраживания и дайте процессу протекать в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия на механическом шейкере.
После удаления буфера для пищеварения трижды смойте гель двумя миллилитрами деионизированной воды. Теперь оставьте гидрогель расширяться в трех миллилитрах деионизированной воды на два часа, меняя воду каждые 30 минут. Для начала включите микроскоп и убедитесь, что источники света прогреты.
Затем откройте программное обеспечение для сбора данных Bioimaging Acquisition Software. Чтобы создать каналы, выберите длины волн возбуждения лазера, соответствующие флуорофорам, и активируйте лазеры соответствующим образом. Выберите подходящий объектив, например 63-кратный масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой 1,4 или эквивалентный.
Теперь поместите и закрепите защитный колпачок диаметром 32 мм в держателе, приспособленном к микроскопу. Поместите образец клеток иммуноокрашивания клетками вниз на 32-миллиметровую защитную крышку и добавьте каплю деионизированной воды, чтобы предотвратить высыхание образца. Затем поместите держатель с защитным колпачком на предметный столик микроскопа над объективом.
Для визуализации после расширения поместите гидрогель на защитное стекло и выполните сканирование плитки. Используйте режим «Светлопольная флуоресценция» или «Флуоресценция с низкой лазерной интенсивностью», чтобы найти интересующую область и сфокусировать ее. Затем задайте параметры получения изображений, такие как скорость сканирования, усредненное число, направление, режим сканирования, метод и размер точечного отверстия, чтобы получить желаемое наблюдение.
Теперь визуализируйте ячейки в программном обеспечении в режиме Live Fluorescence. Постепенно увеличивайте мощность лазера и регулируйте усиление и смещение детектора, чтобы усилить сигнал без внесения чрезмерного шума, обеспечивая четкую визуализацию флуоресценции без передержки. Наконец, выполните получение изображения и сохраните данные в нужном формате, убедившись, что они включают правильные метаданные для использования в будущем.
После завершения сбора добавьте небольшое количество деионизированной воды, чтобы облегчить перенос с помощью пинцета, и перенесите образец обратно в шестилуночный планшет. Средний диаметр ядра Feret увеличился с 17,7 микрометров до расширения до 70,3 микрометров после расширения, что указывает на коэффициент расширения, равный четырем. Картина маркировки фибробластов до экспансионной микроскопии показала заметную красную и зеленую флуоресценцию, указывающую на субклеточные детали в аппарате Гольджи, но с ограниченным разрешением, что предотвращало анализ смерти.
После экспансионной микроскопии наблюдалось значительно повышенное пространственное разрешение субклеточных структур с более сложными зелеными и красными везикулами, видимыми внутри клеток фибробластов.
