골격근에서 Progenitors의 정화

요약

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

초록

골격 근육은 서로 다른 배아 기원과 발달 잠재적 여러 전구 인구가 포함되어 있습니다. 일반적으로 myofiber 플라즈마 막과 ensheaths를 laminin 풍부한 지하 막 사이에 '위성 휴대폰 위치 "에 거주 Myogenic progenitors은, 전적으로 myogenic 혈통 ^1,2하기 위해 최선을 다하고 있습니다 자기 갱신 세포 수 있습니다. 우리는 최근 myofibroblasts 효율적 확산을 입력하여 손상에 대응하고 조직 재생 ^3,4 중 myogenic 세포에 영양 지원을 제공하는 백색 adipocytes을 생성할 수 있습니다 선박 관련 progenitors의 두 번째 클래스를 설명합니다. 주어진 세포 인구의 발달과 재생 가능성을 결정하는 가장 신뢰할 수있는 assays 중 하나는 그들의 고립과 ^5-7 이식에 의존합니다. 이를 위해 우리는이 문서에서 개요 것입니다 효소 dissociated 근육에서 유동세포계측법에 의해 자신의 정화를 위해 프로토콜을 최적화합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 인구는 myogenic 또는 fibro / adipogenic 콜로니 형성 세포 중 하나를 포함합니다 : 다른 세포 유형은 체외에서 확장 또는 생체내 전달에서 살아남기 수 없습니다. 그러나 이러한 인구가 하나가 신선한 정렬 집합이 식민지를 형성하거나 수신자를 engrafting의 능력이 결여되어 다른 오염 물질 세포를 포함할 수 있습니다 점을 염두에 보관해야 분자 분석 (예 : qRT - PCR)에 대한 정렬 즉시 사용할 때.

프로토콜

1. 조직 컬렉션 :

1. 7 일 사이와 12 주 된 마우스를 사용합니다. 보통, 적어도 두 동물이 사용됩니다 : 하나는 보상과 형광 - 마이너스 - 원 isotype 컨트롤 샘플에 필요한 외과 단일 색상 컨트롤을 설정하는 것입니다. 다른 분류에 대한 실제 예제입니다.
2. CO ₂ 흡입하여 쥐를 안락사 또는 선택의 윤리 규정에 따라. 종이 타월, 최대 직면하고, 70 % 에탄올로 스프레이 플레이스 마우스는 철저하게 마우스 모피와 오염을 방지합니다.
3. 포셉와 복부의 피부를 리프트, 그리고 날카로운 가위로 작은 길이 절단합니다.
4. 필 반대 방향으로 피부의 두 날개는 (위, 아래)를 완전히 아래 뒷다리 사지 근육을 노출합니다.
5. 발목 부분의 경골의 양쪽을 따라 가위를 삽입하고 확장하여 엑사이스 근육 조직.
6. 근육 조직을 추출하는 대퇴골에 대해 동일한 과정을 반복합니다.
7. 각 마우스에서 조직 한 접시를 사용하여, 60mm 배양 - 요리의 모든 excised 근육 조직을 놓습니다.
8. 모든 마우스에 대해 위의 단계를 반복합니다.

2. 효소 소화에 의해 단일 ​​셀에 조직을 떼어 놓다 :

프로토콜의이 섹션 동안 살균 시약 및 도구를 사용하여 멸균 조건하에 작동합니다.

9. 각 페트리 접시에 Collagenase - II 2 ML (시그마, 고양이 # 6885, 500u / ML) 및 250mM CaCl ₂ 주식 20 μL를 추가합니다.
10. 많은 오염을 제거하고 폐기에주의를 기울이고이 포셉 (한 톱니 모양의, 파인 과학 도구에서이 치아 한, 고양이 # 11051-10, 11154-10)과 작은 조각 (약 1 mm ^3)로 근육 조직을 테어 가능한 비 근육 조직.
11. 페트리 - 요리를 커버하고 30 분 섭씨 37도에서 그들을 품어.
12. 페트리 - 요리를 검색하고 철저하게 매쉬 조직 조각 3 ML의 주사기의 플런저를 사용합니다. contaminations을 피하기 위해 각 샘플에 대해 하나 플런저를 사용합니다.
13. 각 페트리 - 음식 일부 (~ 5 ML) 살균 차가운 PBS를 추가하고 (필요한 모든 조직을 복구하는 경우 페트리 접시를 씻어 -) 50mL 팔콘 튜브로 조직 슬러지를 전송
14. 적극적으로 팰컨 튜브 쉐이크, PBS로 튜브를 기입, 원심 분리기 @ 800rpm X 5 분 (Eppendorf 벤치 최고 모델 : 5810R), 그리고 표면에 뜨는를 기음 (반복 3 회)
15. 37도에서 품어, 각각의 튜브와 CaCl ₂ 10μL (250mM) : 1mL Collagenase D의 혼합 (로체, ​​고양이 # 11088882001, 1.5u / ML) / Dispase II (04,942,078,001, 2.4u / ML 로체, 고양이 #)을 추가 한 시간 만이라도 회전 섭씨.
16. 감기, 멸균 PBS, 소용돌이 그리고 조직을 균질하기 위해 철저하게 피펫의 50-10 ML을 추가합니다.
17. PBS로 튜브를 가득 채우고 잘 섞는다.
18. 조직의 나머지 큰 조각을 필터링하는 50 ML 팰컨 튜브의 상단에 위치 40μm 셀 스트레이너에 액체를 전송합니다. 고르게 세 50mL 팰컨 튜브에 각각의 샘플을 나누십시오. PBS는 다음 섭씨 8 도에 5 분 @ 1600rpm을 원심 분리기로 튜브의 각을 입력합니다.
19. 뜨는을 취소하고 얼룩을 위해 세포를 수집합니다.

3. 항체 스테 이닝과 정렬 :

프로토콜의이 섹션 동안 살균 외과 및 수집 버퍼를 사용하여 멸균 조건하에 작동합니다. 적절히 치료하면 상업 항체는 일반적으로 멸균 간주됩니다.

20. 단일 색상과 isotype 컨트롤 샘플, 1mL 외과 버퍼에 샘플을 resuspend 아홉 1.5mL 미리 표시 Eppendorf 튜브 (100 μL 각 튜브)에서 일시 중지 세포를 나눕니다.
    1. 단일 색상의 얼룩을 설정하면 다음 표에 따라 믹스 :
       주의 : 착색에 isotype 제어 항체의 최종 농도가 그들이 관리하는 주요 항체의 일치해야합니다. 안티 무서 - 1이 1 μg/10 ⁶ 세포를 사용하는 경우 예를 들어, 해당 isotype은 같은 농도에서 사용해야합니다.
       

       튜브 #	튜브의 이름	회사	고양이 #	클론	isotype	노동 희석
       1	비 - 얼룩
       2	Hoechst33342	시그마	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	시그마	P4864			1ug/ml
       4	CD31 - FITC CD45 - FITC	ebioscience	11-0311-85	390	쥐 IgG2a	500
       		하우스 만든		I3 / 2	쥐 IgG2b	500
       5	Sca1 - PECY7	ebioscience	25-5981-82	D7	쥐 IgG2a	5000
       6	α - 7의 APC	하우스 만든		R2F2	쥐 IgG2b	1000

    2. isotype 제어 얼룩은 다음 테이블을 사용하여 믹스 설정 :
       

       튜브 #	이름 튜브	Hoechst	PI	CD31 - FITC	CD45 - FITC	Scal - PE - CY7	A - 7 - APC	쥐 - IgG2b - APC	쥐 - IgG2a - pecy7	쥐 - IgG2a - FITC	쥐 - IgG2b - FITC
       7	ISO - CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	ISO - Scal - pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	ISO - α - 7 - APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. 단계 20에서 해당 Eppendorf 튜브에 Pipet 단일 색상과 동위 원소 제어 얼룩 믹스를 (우리가 일반적으로 혼합 얼룩 5 사이에 10 μL 각 샘플에 추가되도록 항체의 농도를 조정합니다.) 잘 믹스 1 시간 동안 얼음에 품어.
21. 외과 세포 분류에 대한 항체 칵테일의 800μL (아래)와 샘플 마우스 세포를 얼룩. 잘 믹스 1 시간 동안 얼음에 품어.
    항체 칵테일 : Hoechst, PI, CD31 - FITC, CD45 - FITC, Sca1 - PECY7, α - 7 APC
    주의 : 세포에 항체의 최적 비율은 큰 차이가 일괄 사이에 존재하는 수 있으므로 개별적으로, 각각의 항체를 titrating에 의해 결정되어야합니다. 사용되는 항체의 최적의 금액은 10 ⁶ 표적 세포마다 항체의 μgs 표현과 항체의 동일한 일괄 처리를 사용할 때 지속적인 보관해야합니다. 분명, 대상 세포의 숫자는 실험을 사이에 크게 변화하지 않는 경우, 또는 얼룩 볼륨은 세포의 숫자와 크기를 조정하는 경우, 각 항체의 고정 희석도 사용할 수 있습니다.
22. 세척 : 9 제어 튜브 각 외과 버퍼의 약 1mL에 추가하고, 샘플 튜브에 외과 버퍼의 약 20mL 추가할 수 있습니다.
23. 5 분 Eppendorf 튜브 @ 3000rpm (5417C Eppendorf 벤치 최고 원심 분리기, 모델)을 원심 분리기. 샘플 튜브에게 5​​ 분 @ 1600rpm (5810R Eppendorf 벤치 톱 원심 분리기, 모델)을 원심 분리기.
24. 기음 모든 튜브의 표면에 뜨는를 삭제.
25. 외과 버퍼 (컨트롤 각각에 대해 1mL, 정렬 샘플 4mL)에 Resuspend 세포는 "외과 튜브 '셀 스트레이너 뚜껑을 통해 (BD 팰컨 고양이 # 352235, 40μm 구멍 크기)로 피펫 세포 수 있습니다 남아있는 대단히 짧은 시간을 제거하는 cytometer에 영향을 미칩니다.
26. 단일 색상 컨트롤과 isotype 컨트롤과 함께 외과 분류기를 설정합니다.
27. 3.5 ML 수집 버퍼에서 다음 테이블 (95% DMEM 5 % FBS)에 따라 개별적으로 정렬된 세포를 수집합니다. 일반적으로, 두 뒷다리 손발을 수확하면, 하나의 야생 타입 마우스는 프로 시저의 끝 부분에 외과의 reanalyzing 정렬 세포에 의해 판단 95% 위의 생존과 150,000 myogenic 전구 세포 또는 100,000 adipogenic 전구 세포 (그림 1에 대해 얻을 수 )
    myogenic 및 adipogenic progenitors의 정의는 표면 얼룩을 기반으로
    

    항체는 / 얼룩	Myogenic 시조 (MP)	Adipogenic 시조 (서울 = 연합 뉴스)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31 - FITC	-	-
    CD45 - FITC	-	-
    Sca1 - PECY7	-	+
    α - 7의 APC	+	-

4. 이식 :

28. @ 1500rpm 5 분, autoclaved Eppendorf 튜브 (1.5 ML)에 뜨는 및 전송 세포를 제거 정렬 세포를 원심 분리기, 5 분 @ 3000rpm을 원심 분리기 다음 멸균 PBS (혈청 무료!) 500 μL로 세포를 씻어. 무균 조건에서 모든 시약을 유지하고 조직 문화 후드에서 근무 약 10 ⁶ 세포 / ML에서 PBS에 myogenic progenitors, 또는 Matrigel에서 adipogenic 시조 (BD 고양이 # 354234)을 resuspend.
29. myogenic progenitors 또는받는 마우스로 adipogenic 시조를 이식.
    1. isoflouran이 기관의 정책에 따라와 마우스를 마취시키다.
    2. 사출 지역 주변의 머리를 면도, 다음 70 % 에탄올과 마찰로 피부를 소독
    3. 10분의 3 CC의 인슐린 주사기를 사용하여 myogenic progenitors 또는 adipogenic progenitors (= 20K 세포)의 20μL (BD 고양이 # 309300)을 주사.
30. 적절한 시간 (3 주 잘 작동하지만, 기증자 파생 형질 마커를 표현 myofibers는 이식 수술 후 일주 시간 이내 증거들이) 후, (시그마 고양이 # T04840 - 2, 400 μL Avertin의 intraperitoneal 주사로 단계 29받는 쥐를 마취시키다 25 MG / ML)은 다음 4% PFA의 15mL 다음 50mL PBS (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μm의를 포함) 먼저와 transcardially perfuse. 필요한 경우 하루 20 %의 자당로 전송 후, 밤새 4% PFA와 대상 조직, 사후 수정 사항을 수집합니다. OCT, 동결 및 cryosection에 삽입할 수 있습니다.

5. 대표 결과 :

MP가 마우스 골격근에 이식하는 경우, 그들은 쉽게 기존 myofibers와 퓨즈. 따라서 기증자의 세포에 존재하는 유전자 레이블을받은 섬유에서 쉽게 감지됩니다. 그림 2는 이식 세포, 인간의 알칼리성 phostphatase을 표현 histochemically 발표 예제를 보여줍니다.

AP가 이식 때 결과는 이식 사이트의 환경에 크게 의존 : subcutaneously 이러한 세포 (그림 2 참조) adipocytes와 myofibroblasts에 기원을 제공 이식 때. 지방 변성은 ³ 유도되지 않는 근육을 포함하여 많은 다른 사이트에서는, 그들은 생존하지 않습니다.

그림 1. 골격근의 시조 인구의 격리를위한 전략을 정렬 (A) 정렬 전략 :. 가능한 세포는 앞으로 산란 및 측면 산란을 기반으로 확인되었습니다. Hoechst의 얼룩은 죽은 세포를 제외 anuclear 파편과 propidium 요오드화물의 (PI) 얼룩을 제외하는 데 사용되었다. 조혈 (CD45) 및 내피 (CD31) 세포가 정렬 성문에서 제외되었습니다. α7 ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- Scal ^- 집합은 모든 myogenic progenitors (MP)가 포함되어 있습니다. Scal ⁺ Hoechst ⁺ PI ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- 인구 adipogenic progenitors (AP)가 포함되어 있습니다. (B) 형광 - 마이너스 - 원 (FMO) isotype 컨트롤은 얼룩의 특이성을 확인합니다. (C) 순도가 정렬 후 MP와 AP 하위 집합을 확인합니다.

그림 2. MP와 AP 이식. AP 다음과 같은 대표적인 결과는 subcutaneously 이식 (맨 위 패널)와 MP intramuscularly (하단 패널)되었습니다. 두 경우 모두, 기증자 세포는 갈색 얼룩으로 식별 유전자 변형 인간의 알칼리성 인산 가수 분해 효소를 표현 마우스에서 유래.

토론

이 프로토콜의 목적은 높은 수율과 정화 ​​세포의 높은 생존 능력 사이에 적절한 균형을 공격하는 것입니다. 건강한 세포가 회복되는 보장에서 가장 중요한 단계는 예측할 수, 시작 조직의 효소 분해됩니다. 조직의 처리 증명 또는 시청각 형식도 감사 힘든되는, 특히 부드럽게해야합니다. 또 다른 주요 요인은 절차의 길이입니다. 더 이상 그것은 따라서 낮은 생존하고, engraftment 효율, 기증자로부터받는 동물로 이동 걸립니다. 즉시 정렬 후 정화 세포 샘플에 PI 긍정적인 사건의 빈도를보고하여 답변을하지 않습니다 생존에 대한 질문이있을 경우, 우리는 clonogenicity을 측정하기 위해 제한 희석 분석은 ³ 수행하는 것이 좋습니다. 손상되지 않은 근육의 일반적인 종류는 정기적으로 체외에 myogenic 또는 fibro / adipogenic 식민지를 시작 할 수 15-20 세포의 약 1를 얻을 수 있습니다. 의원에서 시작한 식민지의 기본적 100 % 차별화된 myotubes가 포함되어 있지만, FAPs에서 얻은 식민지 중 고작 1 ~ 세번째는 부드러운 근육 굴지 긍정 myofibroblasts 이외에 adipocytes가 포함되어 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Collagenase II	시그마 - 알드리치	C - 6885,	500 U / ML
Collagenase D	로체	11088882001	1.5 U / ML
II를 치환	로체	04942078001	2.4 U / ML
셀 스트레이너	BD	352340	40 μm의
셀 스트레이너와 관	BD	352235	40 μm의
Hoechst33342	시그마 - 알드리치	B2261	2-5 UG / ML
CD31 - FITC	Ebiosciences	11-0311-85	클론 390
CD45 - FITC	홈 만든		클론 I3 / 2
Sca1 - PECY7	Ebiosciences	25-5981-82	클론 D7
α - 7 인테 APC	홈 만든	로씨 연구실에 문의	R2F2