علاج الإصابات العظمية الغضروفية في مفصل الركبة الأرنب عن طريق زرع خيفي الخلايا الجذعية الوسيطة في الجلطات الليفين

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يوصف تقنية تجريبية لعلاج العيوب عظمي غضروفي في مفصل الركبة الأرنب. غرس خيفي الخلايا الجذعية الوسيطة إلى عيوب عظمي غضروفي يوفر تطور واعد في مجال هندسة الأنسجة. إعداد الليفين خلايا-جلطات في المختبر يوفر طريقة موحدة لزرع.

Abstract

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Protocol

A. إعداد الأرنب المانحة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة (غرفة الجراحة)

يتم عزل الخلايا من الذكور نيوزيلندا الأبيض (NZW) الأرانب جديد في عمر 4 أشهر وحوالي 3 كجم من وزن الجسم.
لحث على التخدير من البروبوفول (10 ملغ / كغ من وزن الجسم الرابع) وتضحية مع الصوديوم بنتوباربيتال (100 ملغ / كغ من وزن الجسم الرابع).
حلاقة فرو من أطرافه الخلفية والظهر والبطن مع المقص الكهربائي والفراغ الفراء.
تطهير المنطقة حليق تماما مع الايثانول 70٪.
استخدام ملقط حادة، مقص حاد (أو مشرط) وقواطع العظام للأنسجة والأربطة.
إجراء شق على طول سطح الجمجمة من الساق والساق.
تعكس الجلد والنسيج تحت الجلد إما عن طريق تشريح حادة أو غير حادة.
العضلات والأربطة منفصلة من الساق وعظم الفخذ. الحفاظ على التخفيضات أقرب إلى عظم قدر ممكن لجعل تشريح نظيفة. لا فصل عظم الفخذ من الساق في هذا الوقت.
قطع عبتيOUGH مفصل الورك للفصل بين رأس عظم الفخذ من الحق.
رفع المجمع الظنبوب-الفخذ.
استخدام شفرة مشرط لكشط أي نوع من الأنسجة الناعمة المتبقية من العظام أو فرك العظام مع الأنسجة قماش معقمة. عند هذه النقطة، عظم الفخذ والساق لا تزال متصلة.
إزالة الرضفة من قبل القطع، ثم تقطع الأربطة مفصل الركبة إلى عظام منفصلة في نهاية المطاف.
رذاذ فصل العظام مع الايثانول 70٪، والسماح الهواء الجاف ووضع كل عظم في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع خلية ثقافة المتوسط (DMEM + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)) للاحتفاظ بها رطبة.
الآن التبديل ظل ثقافة خلية العقيمة تدفق الصفحي هود.

B. فلاشينغ من MSC الأرنب من العظام والتوسع (هود الثقافة الخليوي)

جمع العظام من الأنابيب ووضعها في 150 مم الأطباق باستخدام ملقط معقم.
إزالة كلا الطرفين مع منشار معقمة وقطع خطوة جديدة لملم أطباق 150 العظام.
ملء حقنة 10 مل مع ميدىأم (DMEM)، إرفاق إبرة قياس 18 و إدراج في افتتاح نخاع العظام.
ثم، شطف تجويف نخاع مع المتوسطة لطرد نخاع العظام في طبق. بعد ذلك، شطف من الطرف الآخر، إذا كان ذلك ممكنا. إذا لزم الأمر، ورأى قبالة أكثر من نهايات. إذا عظم ينبغي كسر، فقط شطف داخل العظام.
نضح المتوسطة تعليق خلية في حقنة وشطف نخاع العظام بشكل متكرر حتى التعليق هو التعويم الحر من خلال تجويف نخاع العظام والعظام لا تظهر المزيد من نخاع الجلطات.
مرة واحدة وقد تم جمع نخاع العظم من جميع العظام، وتعطيل كتل نخاع عن طريق تمرير من خلال إبرة قياس 18: ملء المحاقن مع إبرة المرفقة وطرد في المتوسط.
بعد ذلك، تعليق تصفية من خلال مرشح الخلية في أنبوب مل 50. من أجل منع فقدان الخلية، وغسل الثقافة طبق 2X مع 10 مل المتوسطة وتصنف كذلك.
أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج التعليق لمدة 5 دقائق على RT.
إزالة طاف و resuspend خلية بيلوآخرون في 10 مل المتوسطة (DMEM + 1٪ القلم / بكتيريا).
خلايا الدم منفصلة من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC) والخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) باستخدام محلول فصل Biocoll.
ملء 5 مل من Biocoll فصل الحل في أنبوب مل 15 وإضافة بعناية 5 مل من خلية تعليق على رأس وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 20 دقيقة في RT (بدون فرامل).
النتائج الممكنة انظر الشكل 1: كثافة يجري من Biocoll، وخلايا الدم الحمراء الرواسب إلى أسفل بينما تبقى الخلايا الجذعية PBMC والوسيطة في واجهة.
بعناية إزالة واجهة في أنبوب مل 15 و تغسل مع 5 مل PBS.
أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 22، في resuspend 5 مل PBS وكرر 2-3X.
ثم، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 350 x ج لمدة 10 دقيقة في RT (مع الفرامل).
resuspend في 10 مل المتوسطة وعد الخلايا في عدادة الكريات.
لوحة الخلايا في لكثافة البذر الأولية ما يقرب من 5 × 10 ⁶ في 150 ملم الأطباق.
بعد 2-3 أيام، وإعادةنقل الخلايا غير ملتصقة. قد يكون لديك لشطف مع PBS الأول من أجل إزالة الحطام الخلية. أضف المتوسطة كاملة الطازجة (DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) + 1٪ القلم / بكتيريا) بعد ذلك.
تغذية الخلايا كل 3-4 أيام (الشكل 2).
بعد 5-10 أيام، ومرور الخلايا لأول مرة.

C. إعداد جلطات الليفين في المختبر

في يوم من زرع، والإفراج عن الخلايا الملتصقة من قوارير / أطباق من قبل 3 دقائق التعرض إلى 0.25٪ التربسين EDTA-. وقف trypsinization بإضافة المتوسطة كاملة.
توزيع الخلايا في أنبوب 50 مل فالكون وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني.
تحديد بقاء الخلية والأرقام عن طريق التريبان الأزرق تلطيخ.
إضافة 50،000 خلية / أنبوب microcentrifuge وجمع الكريات بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إعداد mastermix واحد على الأقل أكثر تجلط حسب الحاجة.
Resuspend وبيليه الخلية في 17 ميكرولتر PBS وخلط 25 ميكرولتر من الفيبرينوجين مكون من TISSUCOL-كيت مع هذا 17 ميكرولتر التعليق MSC.
تأخذ لوحة العقيمة مع الثقوب قبل حفر (3x3.6 مم) وفقا لحفر ثقوب في الجسم الحي (الشكل 3).
أولا، تطعيم 4 ميكرولتر حل الثرومبين (500 وحدة دولية / مل) في فتحة واحدة، تليها إضافة الفوري ل42 ميكرولتر الفيبرينوجين-الخلوي التعليق ومرة أخرى 4 ميكرولتر حل الثرومبين على القمة. لا تخلط تعليق لتجنب تخثر الدم في الطرف ماصة. أولا، فإن حجم 50 ميكرولتر من pipetted الفيبرينوجين-الخلوي تعليق تبرز حافة الثقوب قبل حفر دون ذوبان بسبب التوتر السطحي. ومع ذلك، بعد تخثر كاملة (بعد 60 دقيقة) الجلطة هو التعاقد وتناسبها في حفرة قبل حفر.
إزالة تجلط بعناية باستخدام ملقط كليلة ومكان في أنبوب microcentrifuge مع برنامج تلفزيوني. إعداد 2 جلطات / حيوان.
خذ جلطات إلى غرفة الجراحة.

D. زرع خيفي الخلايا الجذعية الوسيطة في الجلطات الليفين

لحث على التخدير لأرنب (NZW، ذكر، 3،5-4،0 كجم من وزن الجسم، 5-6 أشهر من العمر) من قبل الرابع حقن البروبوفول (10 ملغ / كغ من وزن الجسم).
يحلق في الركبة وسيتم تشغيلها على مع المقص الكهربائي والفراغ الفراء. يتم تنفيذ كافة الإجراءات اسمه من قبل في غرفة تحضير لعملية جراحية لتجنب تلوث بيئة معقمة من غرفة العمليات.
بعد التنبيب، والحفاظ على التخدير مع 1.5 ملغ / كغ / دقيقة البروبوفول و 0.05 مغ / كغ / دقيقة الفنتانيل عن طريق الوريد. رصد التخدير باستخدام capnography، التأكسج النبض ومعدل النبض.
تطهير الركبة حليق تماما، وتغطي بقية الأرانب بضمادة معقمة.
جس الرضفة وإجراء شق الجلد الإنسي إلى الرضفة.
فتح مفصل الركبة قبل بضع المفصل المحيط بالرضفة الإنسي تحت ظروف معقمة. في محاولة لتجنب قطع أي الأوعية الدموية السطحية الصغيرة.
تهجير الرضفة أفقيا (الشكل 4).
بعد inspeكشن من مفصل الركبة عن أي آفات أو الغضروف يصاحب ذلك الشذوذ مشتركة، إنشاء اثنين من العيوب عظمي غضروفي (3 ملم عميق، على شكل الرقم ثمانية) في الأخدود البكرية مع التشغيل الهواء المعقم الحفر الطاقة (3.6 مليمتر في القطر) مع الجهاز توقف (الشكل 5).
تنظيف العيوب وشطف لهم مع ملحي معقم.
قبل الزرع، وملء 20 ميكرولتر من الليفين الغراء في العيوب وتوزيعها بالتساوي على الجزء السفلي من خلل.
ثم زرع جلطات الصحافة المجهزة في الشكل عيب على شكل ثمانية.
بعد تخثر الدم، انتقال الرضفة داخل أخدود البكرية وثني الركبة وامتداد عدة مرات.
تهجير الرضفة أفقيا مرة أخرى وتحقق IF-جلطات الفيبرينوجين خلايا لا تزال في مكانها.
استبدال الرضفة مرة أخرى، وإنهاء العملية مع إغلاق الجرح في طبقات مع الغرز زر واحد (VICRYL 4-0) وخياطة الجلدي المستمر (Monocryl 4-0) (على حد سواء مع خياطة للامتصاصمادة).
وأخيرا، ختم الجرح مع رذاذ خلع الملابس نفاذا إلى بخار الماء.
للحصول على الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، يتم فحص الجرح يوميا لمدة 7 أيام. الأرانب تلقي اللاحقة للعمليات تسكين كاربروفين 4 ملغ / كغ كل 24 ساعة SC (لمدة 4 أيام) وBuprenorphin 0.03 مغ / كغ كل 12 ساعة SC (لمدة 2.5 أيام). لتحقيق الاستقرار في الركبة (مثل خلع الملابس) ليست ضرورية.