L'utilisation d'une fenêtre crânien à la Visualisez l'artère cérébrale moyenne pendant l'endothéline-1 induite par l'occlusion Artère cérébrale moyenne

Résumé

Cet article décrit une méthode pour visualiser les artères cérébrales de rats à travers une fenêtre crânienne à l'aide craniectomie temporelle afin de voir les parties proximales de l'artère cérébrale moyenne ( Figure 1). Cette méthode polyvalent peut être combiné avec différentes techniques de délivrance de médicaments à mesurer la réactivité artère cérébrale In vivo.

Résumé

Création d'une fenêtre crânienne est une méthode qui permet la visualisation directe des structures sur la surface corticale du cerveau ^1-3. Cette technique peut être réalisée dans de nombreux endroits qui recouvrent le cerveau du rat, mais est plus facilement réalisée par la création d'une craniectomie sur les os facilement accessibles frontale ou pariétale. Le plus souvent, nous avons utilisé cette technique en combinaison avec le modèle de l'endothéline-1 occlusion de l'artère cérébrale d'accident vasculaire cérébral ischémique à quantifier les changements de milieu diamètre de l'artère cérébrale navire qui se produisent avec l'injection de l'endothéline-1 dans le parenchyme cérébral adjacent au proximale MCA ^{4, 5.} Afin de visualiser la partie proximale de la MCA au cours de l'endothéline -1 MCAO induite, nous utilisons une technique pour créer une fenêtre crânienne à travers l'os temporal sur la face latérale du crâne de rat (figure 1). Artères cérébrales peuvent être visualisés soit avec la dure-mère intacte ou avec la mère et incisé retrala Direction exécutive. Le plus souvent, nous laissons intacte la durée pendant la visualisation depuis l'endothéline-1 induite par MCAO implique la livraison du peptide vasoconstricteur dans le parenchyme cérébral. Cela évite la nécessité d'inciser la dure-mère directement sur les vaisseaux visualisés pour l'administration de médicaments. Ce protocole décrit comment créer une fenêtre crânienne de visualiser les artères cérébrales d'une manière progressive, ainsi que la façon d'éviter de nombreux pièges potentiels liés à cette méthode.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Floride et est en conformité avec le «Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire" (huitième édition, National Academy of Sciences, 2011).

Matériels

1. Animaux: Huit semaines d'âge, de sexe masculin, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) pesant 250-300 g au moment de la chirurgie.
2. Anesthésie
   1. Système d'anesthésie par inhalation (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
   2. L'isoflurane anesthésie (Pharmacie Baxter, Deerfield, IL, USA)
3. Stéréotaxique système (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Petit système stéréotaxique animaux
   2. Non-rupture des barres d'oreilles pour les rats
   3. Support de la tête anesthésie gazeuse pour les rats
4. Régulation de la température
   1. BAT-12 Thermomètre microsonde (WorldPrecision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. T / PUMP, TP600 couverture thermique (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, État de New York, Etats-Unis)
5. Les instruments chirurgicaux
   1. Ciseaux Metzenbaum, pince à iris, les rétracteurs de serrage bulldog, une seringue de 10 ul avec 26 aiguille de la jauge biseauté, Bovie cautérisation kit (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. Micromoteur forage (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm ronde foret fraise (Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn suture Pinces (Bausch and Lomb, Inc, Rochester, NY, USA)
6. Fournitures chirurgicales
   1. 3,0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Des cotons-tiges, pommade ophtalmique Puralube (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   3. Les points chirurgicaux et bandes (Medtronic Xomed, Inc, Jacksonville, FL, USA)
   4. Tondeuses à cheveux électriques (Oster, Providence, RI, USA)
7. Produits chimiques
   1. L'endothéline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidine à 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
8. Équipements de visualisation
   1. Microscope chirurgical (Seiler Instrument et fabrication; St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japon)
   3. Fibre optique d'éclairage (Techniquip Corp, Livermore, CA, USA)
9. Mesure de diamètre du vaisseau
   1. VLC media player (Paris, France)
   2. Image J logiciels (ImageJ 1.42q logiciel, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pré-chirurgicaux étapes

1. Avant la chirurgie, les rats sont logés sous un 12:12 lumière / obscurité cycle avec libre accès à l'eau et rongeur.
2. L'anesthésie est induite avec 4% d'isoflurane dans 100% d'O ₂ en mélange de gaz d'une chambre d'induction.
3. Le corbeau n de la tête est rasée avec une tondeuse à cheveux électriques.
4. Le rat est placé dans une position couchée sur un coussin absorbant allongé sur une surface de commande à régulation de température (couverture thermique) et la tête est placée dans l'appareil de stéréotaxie en commençant par le placement de la face d'un masque à gaz anesthésique.
5. Ensuite, les barres d'oreilles sont insérés et serrés.
6. Au cours de la procédure d'anesthésie est maintenue avec 2% d'isoflurane dans 100% d'O mélange de gaz _2.
7. Pommade ophtalmique lubrifiante est appliquée aux deux yeux et les paupières sont fermées pour empêcher le dessèchement des yeux pendant l'intervention chirurgicale.
8. Une sonde de température rectale est insérée pour maintenir une température constante pour animaux noyau de 37 ± 0,5 ° C.
9. A la tête du rat anesthésié maintenu fermement dans l'appareil stéréotaxique la zone chirurgicale est nettoyée avec une alternance de chlorhexidine et de sérum physiologique à trois reprises.

2. Préparation fenêtre pré-crânienne

ontenu "> Avant de créer une fenêtre crânienne, le rat doit être préparé pour toutes les expériences de l'implantation d'autre matériel nécessaire et doit recevoir toutes les procédures nécessaires chirurgicales. Par ce protocole, nous avons déjà implanté une canule guide pour l'endothéline-1 (ET- 1) induite par MCAO comme indiqué dans une publication intitulée "L'endothéline-1 induite Moyen Modèle occlusion de l'artère cérébrale pour AVC ischémique avec guidage laser Doppler chez le rat."

3. Création de la fenêtre crânienne

Après mise en place d'une canule de guidage ou de l'équipement nécessaire pour l'expérimentation, une fenêtre crânienne est créé pour visualiser directement portions proximale de l'artère cérébrale moyenne au cours d'une procédure d'accident vasculaire cérébral.

1. Tout d'abord, les ciseaux sont utilisés pour inciser la peau recouvrant le muscle temporal à partir médialement et latéralement de travail.
2. Le muscle temporal est coupé en deux en utilisant l'électrocoagulation et ensuite rétracté en utilisant 3,0 suture en nylon pour visua liser la partie squameuse de l'os temporal.
3. Un carré d'environ 3-4 mm est dessiné sur la partie squameuse de l'os temporal caudale de l'orbite et supérieur à la base de l'apophyse zygomatique, car il reflète hors de l'os temporal.
4. Un forage est utilisé pour réduire progressivement la pièce ébauchée de l'os sans l'os temporal. Des précautions doivent être prises pour éviter d'appliquer trop de pression sur la perceuse, car il est possible d'endommager la mère ou le cortex cérébral.
5. Rinçages fréquents avec du sérum physiologique stérile sont réalisés pour améliorer la visualisation du champ opératoire et éviter une surchauffe du crâne.
6. A partir d'un coin de meuble, le morceau d'os temoporal est soigneusement enlevé à l'aide de fines pinces à dents de rat tout en veillant à ne pas déchirer les vaisseaux associés à la dure-mère.
7. La durée est laissée intacte et les débris sont éliminés par rinçage utilisant une solution saline stérile.

4. Enregistrement de constriction Artère cérébrale

tente "> Pour montrer comment capturer des images en temps réel, un rat qui fait l'objet d'ET-1 induite par MCAO est utilisé pour ce protocole.

1. Avant l'application de composés vasoactifs, une vidéo de base doivent être enregistrées pendant au moins 1 min. Pour l'ET-1 induite par MCAO, l'enregistrement de base est effectué une fois que l'aiguille a été descendu dans le parenchyme cérébral, mais avant l'injection d'ET-1.
2. La pompe à seringue pour injection est démarrée et enregistrée pendant 1 heure ou jusqu'à ce que le point limite désiré. L'aiguille est laissée en place pendant l'enregistrement vidéo afin d'éviter des perturbations sur le plan focal.
3. Le rat doit être profondément anesthésié et euthanasiés selon un protocole approuvé à la suite de cette procédure.

5. Analyse d'images

Diamètre du vaisseau peut être déterminé pour chaque partie de la visualisé MCA. A titre d'exemple, nous allons utiliser une branche de la MCA pour mesurer le diamètre des vaisseaux au temps des points avant et après l'injection d'ET-1. Still images de la vidéo sont enregistrées à intervalles de 1 min en utilisant VLC media player (VideoLAN).

1. VLC player est installé et ouvert.
2. En choisissant des outils et des préférences puis, le réglage est changé sur "Tout" sous "Afficher les paramètres."
3. Le menu "vidéo" est détendu dans la barre latérale gauche et "modules de sortie" est ensuite détendu. «Filtres Scene" est sélectionné pour faire apparaître le menu vidéo scène filtre.
4. "Scène" est tapé dans la zone de préfixe du nom.
5. Un préfixe chemin de répertoire est défini. C'est là que des images fixes sont enregistrées.
6. Un rapport d'enregistrement est sélectionné sur la base de la vitesse désirée de capture d'image fixe. Si une vidéo a été capturée à 29 images par seconde, puis "1749" (29 images / sec x 60 s / min) doit être inscrit dans la case pour enregistrer une image fixe toutes les 1 minutes. Toutes les modifications sont alors enregistrées.
7. La vidéo souhaitée est alors ouvert dans le lecteur VLC pour enregistrer automatiquement des images fixes une fois toutes les 1 minutes.
8. Diamètre du vaisseau est ensuite mesurée à l'aide de cesimages. Tout d'abord, le logiciel ImageJ (NIH) est ouvert.
9. Ensuite, les images fixes que vous mesurerez sont ouverts dans ImageJ.
10. En sélectionnant l'option "analyser" menu ", définir des mesures" est alors ouverte et toutes les cases ne sont pas cochées.
11. Ensuite, l'outil de ligne droite est sélectionnée.
12. Le raccourci clavier "Ctrl +" est utilisé pour zoomer en fonction des besoins et une ligne est placée perpendiculairement à la trajectoire navire pour mesurer le diamètre des vaisseaux.
13. Enfin, la longueur du navire est obtenue en sélectionnant l'option "analyser" menu, puis "mesure" (ctrl + M) pour obtenir la longueur du navire.
14. Cette opération est répétée au moins trois fois et la moyenne pour chaque récipient de mesure mesurée dans chaque image fixe.
15. Diamètre du vaisseau à chaque point dans le temps est normalisé au diamètre du vaisseau de référence de sorte que les comparaisons peuvent être faites sur des rats multiples. Pour ce faire, utilisez la formule actuelle diamètre / base de diamètre x 100% pour calculer le diamètre de base% de chaque navire.

Résultats

Les images fixes prises à partir de l'émission vidéo capturée que le changement de diamètre de l'artère cérébrale après injection d'ET-1 peut être facilement apprécié en utilisant cette technique fenêtre crânienne (Figure 2). Quelques minutes après l'injection d'ET-1, le navire commence à serrer. Finalement, les navires seront difficiles à visualiser et le tissu cérébral devient pâle. Après environ 20 minutes, les effets de l'ET-1 diminuera et les navires com...

Discussion

En résumé, cette technique de la fenêtre crânienne préparation est très polyvalent car il peut être modifié pour répondre aux besoins de nombreuses expériences avec des modifications mineures ^{4, 5.} Par exemple, nous avons réussi à surveiller le débit sanguin cérébral dans les branches MCA spécifiques en utilisant la vélocimétrie laser se concentrer directement sur une artère cérébrale visualisée à travers une fenêtre crânienne (la Mecque AP 2009 et 2011). En outre, une préparation si...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Système d'anesthésie par inhalation	VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA	901806
L'isoflurane anesthésie	Pharmacie Baxter, Deerfield, IL, USA	1001936060
Petit système stéréotaxique animaux	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Les non-rupture barres d'oreilles, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat de gaz d'anesthésie tête porte-	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 Thermomètre microsonde	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	BAT-12
T / PUMP, une couverture thermique	Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, État de New York, Etats-Unis	T / PUMP, TP600
Ciseaux Metzenbaum	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	501254
Pince à iris	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	15915
Bulldog rétracteurs de serrage	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	14119-G
Seringue de 10 ul de 26 gaugue	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	SGE010RNS
Bovie, kit haute température cautérisation	Mondiale Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA	500392
Dents de rat Pince 0,12	Stotz	E1811
Perceuse micromoteur	Stoelting,Wood Dale, IL, USA	51449
0,8 mm foret fraise ronde	Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suture pince	Bausch and Lomb, Inc, Rochester, NY, USA
Nylon Suture, taille 3,0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Des cotons-tiges	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	22-029-488
Pommade ophtalmique Puralube	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	NC0138063
Tondeuses à cheveux électriques	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 dilué à 80 μ M de concentration dans du PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
La chlorhexidine à 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev 6-06, CNA n °: 10580322
Microscope d'opération	Seiler Instrument et de la fabrication, St. Louis, MO, USA	Evolution XR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japon	HDR-SR12
Fibre optique d'éclairage	Techniquip Corp, Livermore, Californie, USA	FO1-150
VLC Media Player	(Paris, France)
Image J logiciels	US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA