Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

Zusammenfassung

Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Zusammenfassung

Die photothrombotic Hubmodell zielt auf eine ischämische Schädigung innerhalb einer bestimmten kortikalen Bereich mittels Foto-Aktivierung eines zuvor injizierten lichtempfindlichen Farbstoff induzieren. Nach der Belichtung wird der Farbstoff aktiviert und Singulett-Sauerstoff, die Schäden Komponenten Endothelzellen Membranen mit anschließender Thrombozytenaggregation und Thrombenbildung, die schließlich bestimmt, die Unterbrechung der lokalen Durchblutung. Dieser Ansatz, der ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 vorgeschlagen, wurde später von Watson im Jahr 1985 verbesserte sich im Rattenhirn und stellen die Grundlage für das aktuelle Modell. Auch die zunehmende Verfügbarkeit von transgenen Mauslinien weiter dazu beigetragen, das Interesse an der Photothrombose Modell zu erhöhen. Kurz gesagt, wird eine lichtempfindliche Farbstoff (Rose Bengal) intraperitoneal injiziert und gelangt in den Blutkreislauf. Wenn von einer Kaltlichtquelle beleuchtet wird, wird der Farbstoff aktiviert und induziert Endothelschädigung mit Thrombozytenaktivierung und Thrombose, was zu lokalenBlutfluss Unterbrechung. Die Lichtquelle kann auf dem intakten Schädel ohne Notwendigkeit der Kraniotomie, die ein Targeting jeder kortikalen Bereich von Interesse in einer reproduzierbaren und nicht-invasive Art und Weise angewendet werden können. Die Maus wird dann vernäht und erlaubt aufzuwachen. Die Auswertung der ischämischen Schädigung schnell von Triphenyl-Tetrazoliumchlorid oder Kresylviolett Färbung durchgeführt werden. Diese Technik erzeugt Infarkt der geringen Größe und gut abgegrenzt Grenzen, was sehr vorteilhaft für die präzise Charakterisierung Zelle oder funktionelle Studien ist. Weiterhin ist es besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Einleitung

Zu Beginn des 21. Jahrhunderts, ist ischämischem Schlaganfall eine verheerende Krankheit, die die zweite Ursache für langfristige Behinderung ¹ und die zweithäufigste Todesursache weltweit, in denen Schlaganfall etwa 5,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2004 entfielen ² darstellt. Trotz der vielen Anstrengungen, die gesetzt wurden in, gibt es noch keine wirksame Behandlung zur Verfügung funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall verbessern. Tiermodelle von Schlaganfall sind weit verbreitet im Bereich der Hub Forschung verwendet, da sie Modellierung der Pathophysiologie des ischämischen Schadens und damit Prüfung der Wirksamkeit verschiedener neuroprotektive Strategien in vivo. Die meisten dieser Modelle sollen umfangreiche Infarkte durch Unterbrechung (vorübergehend oder dauerhaft) den Blutfluss in der Arteria cerebri media, während andere Modelle wurden entwickelt, um Läsionen der geringen Größe in bestimmten Bereichen, in der Regel der Motor und somatosensorischen Kortex studieren zu induzieren. Allerdings können mehrere Faktoren beitragen, ac erzeugenn eingetragen Maß an Variabilität in experimentellem Schlaganfall Studien, einschließlich der Maus-Stamm verwendet, dem Alter und Geschlecht der Tiere in die Studie eingeschlossen und vor allem hat die Technik, um die ischämische Schädigung induzieren. Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt, der Dauer und Invasivität der Operation (dh die Notwendigkeit einer Kraniotomie) sowie der chirurgischen Geschick erforderlich, um den Bediener zuverlässig induzieren einen ischämischen Läsion sind kritische Faktoren für eine erfolgreiche und unvoreingenommene in vivo Studie Schlaganfall .

Das Konzept wurde ursprünglich von Photothrombose Rosenblum und El-Sabban 1977 ³ vorgeschlagen und wurde berühmt durch ihre Anwendung im Rattenhirn von Watson et al 1985 ^4, in dem die Technik wurde weitgehend verbessert und stellen die Basis des aktuellen Modells ^{3. - 6.} Die photothrombotic Ansatz zielt auf eine kortikale Infarkt durch die Foto-Aktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoff zuvor in Blutsystem, wh geliefert induzierenich ergibt lokalen Gefäß Thrombose in den Bereichen die dem Licht ausgesetzt. Wenn der zirkulierenden Farbstoff bei der geeigneten Wellenlänge wird von einer Kaltlichtquelle beleuchtet, gibt es Energie, um Sauerstoff-Moleküle, die wiederum erzeugen eine große Menge von hochreaktiven Singulettsauerstoff Produkte. Diese Sauerstoff-Zwischenstufen induzieren Endothelzellmembran Peroxidation führt zu Blutplättchen-Adhäsion und-Aggregation und schließlich zur Bildung von Thromben lokalen zerebralen Flussunterbrechung ⁷ zu bestimmen.

Photothrombose ist ein nicht-kanonischen ischämischen Modell, das nicht verstopfen nicht oder brechen nur eine Arterie, wie es geschieht in der Regel in der menschlichen Schlaganfall, sondern induziert Läsionen in mehr oberflächlichen Gefäße, die in selektive Unterbrechung des Blutflusses in den Bereichen Licht ausgesetzt ergibt. Aus diesem Grund kann dieser Ansatz für Zell-und molekularbiologische Untersuchungen der kortikalen Plastizität. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit der Ausführung.1 min, um die Kopfhaut rasieren;; 3-5 min, um das Tier auf der stereotaktischen Gerät zu platzieren; Darüber hinaus können Photothrombose leicht in ca. 40 Minuten pro Tier, einschließlich zwanzig Minuten Wartezeit (3 min für Anästhesie durchgeführt werden 2 min auf die schrubben Kopfhaut mit einer antiseptischen Lösung, einen Einschnitt machen und reinigen Sie den Schädel; 2 bis 4 min, um die kalte Licht Faser platzieren; 1 min bis die Rose Bengal Lösung zu injizieren; 5 Minuten Wartezeit für die intraperitoneale Diffusion; 15 min von Beleuchtung und 5 min auf Reinigen Sie die Wunde und Naht das Tier). Darüber hinaus ist keine chirurgische Know-how benötigt, um diese Technik durchzuführen, wie die Läsion durch einfache Beleuchtung des intakten Schädel induziert wird. Im Gegensatz zu klassischen Arterienverschluss Diese Methode ermittelt selektive Verschlüsse Pia und intraparenchymal microvessels innerhalb der bestrahlten Zone und verringert die Variabilität unter Läsionen keine Sicherheiten Behälter gelassen wird Sauerstoff in dem Zielgebiet zu liefern.

Trotz seiner besonderen Art, derphotothrombotic Schäden Aktien wesentlichen Mechanismen auftretenden Hirnschlag. Ähnlich wie in der menschlichen Arteria Schlaganfall bestimmen Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung Unterbrechung des Blutflusses in der bestrahlten Fläche ^7. Ebenso auch dieses Modell teilt wesentliche Entzündungsreaktionen wie in Mitte Zerebralarterie ^8. Da jedoch der gut abgegrenzt Grenzen ist die Penumbra-Zone, die zu einem Bereich des teilweise erhaltenen Stoffwechsel entspricht, sehr reduzierten oder existiert nach einem photothrombotic Läsion. Diese klare Grenze kann die Untersuchung von zellulären Reaktionen innerhalb ischämischen oder intakten kortikalen Bereich zu erleichtern. Photothrombose Mausmodell eignet sich besonders für Untersuchungen Hub in eine Vielzahl von transgenen Tieren. Tatsächlich klassischen Modelle können nicht an allen Stämmen und längere Studien in C57BL / 6 Maus-Stamm berichtet eine hohe Sterblichkeit Verhältnis, das Bias ⁹ führen kann passen.

Protokoll

1. Pre-Chirurgie

1. Wiegen Rose Bengal in einer 1,5-ml-Röhrchen und lösen sich in steriler Kochsalzlösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 15 mg / ml. Man filtriert durch ein 0,2 um Filter zu sterilisieren und speichern sie in der Dunkelheit bei Raumtemperatur bis zu zwei Monate.
2. Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren. Der OP-Bereich sollte weniger als eine Stunde vor dem Start der Operation sterilisiert werden.
3. Notieren Sie die Maus Körpergewicht, die Dosis von Rose Bengal injiziert werden anzupassen. Wir injizierten 10 ul / g Gewicht des Tieres in der weiblichen CD1-Mäusen 12 Wochen alt in der vorliegenden Protokoll. Die Höhe der Rose Bengal benötigt um die gewünschte kortikalen Läsion Größe leicht in einer separaten Reihe von Vorversuchen werden durch das Testen verschiedener Dosierungen (in der Regel 2 ul / g, 5 ul / g oder 10 ul / g Körpergewicht) bestimmt. Beachten Sie, dass die Menge von Rose Bengal injiziert werden stark von den experimentellen Bedingungen ist, insbesondere der Art der Lichtquellesowie die Dauer der Belichtung. In der vorliegenden Studie wurden 10 ul / g (150 g / g) Dosis erwies sich als notwendig, Photothrombose bei Einwirkung von Licht für 15 Minuten zu induzieren, während andere Gruppen berichtet, dass entweder 50 ug / g ^6,8 und 100 ug / g ¹⁰ intraperitoneale Injektion war ausreichend zur Induktion einer photothrombotic Läsion.

2. Anästhesie Vorgehen

1. Anesthetize Mäuse mit Isofluran in einem transparenten Ansaugkammer (3,5-4% für die Induktion, 1.5-2% zur Aufrechterhaltung) in 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) Distickstoffmonoxid Gasgemisch. Gasförmige Anästhesie ermöglicht eine schnelle Aufwachen der Tiere und das Niveau der Narkosegas kann leicht angepasst werden. Alternativ können Mäuse auch betäubt werden durch eine Ketamin-Xylazin Mischung.
2. Wenn tiefe Narkose erreicht ist, entfernen Sie den narkotisierten Tier aus der Induktion Kammer, legen Sie es in den stereotaktischen Rahmen und Aufrechterhaltung einer Narkose mit einer Gesichtsmaske. Stellen Sie die isoflurane Dosis eine ausreichende Anästhesie Niveau zu erreichen. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten Verfahrens und stellen Sie sicher, es ist konstant (40 - 60 Atemzüge pro Minute).
3. Verwenden Zeh drückt, um sicherzustellen, das Tier tief narkotisiert.
4. Bewerben Augensalbe, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
5. Schieben Sie die rektale Sonde, um die Temperatur in den chirurgischen Verfahren zu überwachen. Stellen Sie die zugehörigen rückkopplungsgesteuerten Heizkissen für die Aufrechterhaltung der Maus Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 ° C.

3. Chirurgie für die Illumination der Zielfläche

1. Rasur der Maus Kopfhaut mit einem elektrischen Rasierer.
2. Fest sichern den Kopf und legen Sie die Ohr Bars in äusseren Gehörgang. Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen Trommelfelle.
3. Desinfizieren Sie die Haut auf der Oberfläche mit wechselnden Seitenhiebe von 70% Ethanol und betadine mit Wattestäbchen.
4. Mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie machen aus dem Auge leVel bis in den Nacken. Wenden Sie Haut Aufrolleinrichtungen zu halten, der Schädel freigelegt.
5. Vorsichtig einfahren Periost zu den Rändern des Schädels mit einem Skalpell und lassen den Schädel Oberfläche trocknen mit sterilen Wattestäbchen. Identifizieren Sie die Bregma und Lambda. Legen Sie eine Glasmikropipette am Bregma als Bezugspunkt, dann verschieben Sie sie in den Koordinaten der Region von Interesse. Die Region von Interesse für diesen Artikel ausgewählt ist etwa rundweg geformt, zentriert etwa 2 mm lateral der Bregma und bedeckt eine Fläche von etwa 30 mm ^2, die einen großen Teil des sensomotorischen Kortex umfasst nach der Maus Gehirn Atlas von Franklin und Paxinos ^11.
6. Markieren Sie die Position von Interesse mit Bezugspunkten und legte einen Lichtwellenleiter in engem Kontakt mit dem Schädel Oberfläche der Lichtstreuung zu vermeiden, aber achten Sie nicht, um Druck auf sie auszuüben. Der beleuchtete Bereich durch Aufbringen auf den Schädel einer Maske mit kleinen Öffnung oder eine Kappe an der Spitze der optischen Faser GUI eingeschränktde.

4. Rose Bengal Injection und Aktivierung

1. Laden der Rose Bengal Lösung in einer 1 ml Spritze und berechnen die nach einer Dosis von 10 ul / g Körpergewicht injiziert werden.
2. Gehen Sie zu einem langsamen intraperitoneale Injektion.
3. Lassen Sie den Farbstoff diffus und in die Blutbahn eindringen. Nach 5 min auf dem Kaltlichtbeleuchtung wechseln. Vermeiden Beleuchtung des Tieres durch eine andere Lichtquelle. Wir verwendeten Glasfaser-Beleuchtung von 150 W Intensität.
4. Nach 15 min der Beleuchtung, Bremslicht Belichtung und vernähen die Wunde. Fünf Minuten Beleuchtung produzieren bereits Infarkt und 10 min dürfte ausreichen, um eine maximale Wirkung zu erhalten ^12. Um die Variabilität zu minimieren, wählen wir für 15 min zu beleuchten.

5. Naht

1. Entfernen Sie die Haut Gurtstraffer und gelten steriler Kochsalzlösung, um eine Dehydratation zu vermeiden.
2. Schließen Sie die Wunde mit Reverse Schneiden needle und Seide oder Nylon Faden.
3. Unterbrechen Anästhesie, entfernen Sie vorsichtig mit der Maus aus dem stereotaktischen Apparat und legte es auf einen vorgewärmten Heizkissen, bis es vollständig wach ist, dann wieder in seinen Käfig. Die Körpertemperatur sollte sorgfältig im Laufe der Verfahren überwacht werden, um die Variabilität in der Infarkt-Erweiterung zu begrenzen. Nach der Konzentration und der Art der Verabreichung, Rose Bengal immer noch in den Blutstrom über mehrere Stunden nach der Injektion ¹³ detektiert werden. Ziehe die Heizdecke an Wärmelampe potenziellen Folgeschäden (Rose Bengal Absorption Wellenlänge im grünen Spektrum) zu vermeiden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wird einen kortikalen Läsionen, die bereits sichtbar auf Dissektion der Rinde mit dem bloßen Auge (1A bis 1C). Die photothrombotic Läsion entwickelt in oberflächlichen und tiefen kortikalen Schichten, in denen das Gewebe ausreichend durchscheinend ist, um das Foto-Aktivierung des Rose Bengal zu ermöglichen. Messung des Ausmaßes der Hirninfarkt schnell durch histologische Färbung durchgeführt werden mit Triphenyl-Tetrazoliumchlorid (TTC) auf einem Gewebe oder Kresylviolett nach F...

Diskussion

Modifikationen und Substitutionen

Wegen seiner Absorptions-Peak bei 562 nm, wurde ein grünes Licht Laser aus einer gefilterten Xenonbogenlampe ursprünglich gewählt, um die lichtempfindliche Rose Bengal bestrahlen. Obwohl Laser-vermittelte Erregung wurde noch recently5 verwendet, kann es durch Kaltlichtlampe ersetzt werden, auch dafür sorgen, Farbstoffanregung ^10,15. Kaltlicht optischen Fasern sind leichter zu manipulieren und weniger teuer als Laserquellen. Es sollte jedoch bemer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made