La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

Resumen

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

Resumen

Con el fin de investigar los hechos de conducir el desarrollo del corazón y determinar los mecanismos moleculares que conducen a enfermedades del miocardio en los seres humanos, es fundamental primero para generar cardiomiocitos humanos funcionales (CM). El uso de estas células en el descubrimiento de fármacos y estudios de toxicología también sería altamente beneficioso, permitiendo que las nuevas moléculas farmacológicas para el tratamiento de trastornos cardíacos que ser validado pre-clínicamente en las células de origen humano. De las posibles fuentes de CM, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se encuentran entre los más prometedores, ya que se pueden derivar directamente de tejido del paciente fácilmente accesibles y poseen una capacidad intrínseca para dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo ^1. Se han propuesto varios métodos para la diferenciación de las células iPS en los CM, que van desde los clásicos cuerpos embrioides (EB) enfoque de agregación de química definida protocolos de ^2,3. En este artículo se propone un protocolo basado en EBS y mostrar cómo esta metod se puede emplear para generar de manera eficiente las células CM-como funcionales a partir de células iPS alimentador-libres.

Introducción

Históricamente, la investigación de los mecanismos genéticos y moleculares de conducción desarrollo humano y la enfermedad se ha basado en la generación de modelos animales genéticamente modificados. Sin embargo, numerosos fenotipos humanos no pueden ser replicados con éxito en ratones, principalmente a causa de las diferencias biológicas existentes entre las dos especies. Por otra parte, el acceso a los tejidos humanos puede ser limitada y con frecuencia no permita que el material suficiente para obtener por estudios experimentales en profundidad. El campo de la biología cardiovascular sufre de estas dos limitaciones: la fisiología del corazón humano es significativamente diferente de la del ratón, y una cantidad significativa de tejido del corazón es accesible solamente post mortem o durante una cirugía de corazón. Encontrar una fuente óptima para la diferenciación funcional de los CM humana por lo tanto se ha convertido en un tema central en la biología cardiovascular, y se ha hecho un gran esfuerzo para hacer frente a este problema. Se han propuesto diversos tipos de células, itales como grapas de mioblastos esqueléticos, células locales cardíacos madre, células mononucleares de médula ósea, progenitoras endoteliales, y células madre mesenquimales. Sin embargo, los datos obtenidos usando estas células no han sido consistentes ^4.

La obtención de células madre embrionarias (ESC) primero ⁵ y el descubrimiento revolucionario de la madre (iPS) a las células pluripotentes inducidas por Yamanaka y Thomson ^6,7 después parecía ofrecer soluciones: estas células tienen la capacidad de crecer indefinidamente y el potencial de dar la altura de todos los derivados de células de las tres capas germinales, incluyendo los CM. El uso de células iPS ofrece otras ventajas: ser derivados a partir de células adultas autólogas, que llevan el mismo genoma que el individuo o paciente de la que se derivan. Por lo tanto, permiten el desarrollo de modelos in vitro que facilitan la investigación de enfermedades genéticas humanas y los mecanismos de desarrollo. En virtud de esta característica, las células iPS pueden øvercome problemas relacionados con el rechazo inmunológico y las cuestiones éticas ^8. Por estas razones, a pesar de que los CES aún representan el estándar de oro en el campo de la biología de células madre, los investigadores en todo el mundo se está moviendo más hacia la tecnología de células iPS.

células iPS ahora se están empleando para modelar enfermedades humanas in vitro para varias condiciones, incluyendo trastornos cardiovasculares congénitos ^9,10. Recientemente, la aplicación de modelado de la enfermedad de células iPS se ha realizado durante monogénicas trastornos cardíacos (por ejemplo, síndromes de QT largo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica) y patologías en las que los defectos cardíacos son parte de un complejo fenotipo (es decir, Leopard y síndromes Timothy, cardiomiopatía dilatada). Estos informes confirman que las células iPS de pacientes específicos que se diferencian en los CM presentan características fenotípicas y funcionales similares a la enfermedad in vivo.

Sin embargo, hayquedan muchos retos para mejorar la eficacia de la inducción de las células iPS en el linaje cardiaco. La generación espontánea de los CM de CME humanas a través de la formación de agregados llamados cuerpos embrioides (EB) han probado con éxito ^17. Desde este descubrimiento, se han propuesto muchos otros métodos. Muchos grupos han mejorado considerablemente la eficiencia del protocolo de diferenciación y se han movido hacia los reactivos de cultivo químicamente definidos y de productos animales libres (ver Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para una revisión exhaustiva de todos los métodos existentes ³ ).

Sin embargo, el método clásico basado en EB agregación todavía representa el más comúnmente empleado para la realización de estudios funcionales y la investigación de mecanismos de la enfermedad. Nuestro protocolo propuesto se basa en la agregación de las células iPS en EBs y cultivo en presencia de suero y ácido ascórbico, que se ha demostrado para mejorar el proceso de diferenciación cardiaca y para positively afectar a la maduración de estas células ^18,19. En este artículo vamos a ir a través de esta metodología en detalle y mostraremos cómo utilizar iPS alimentador libres de líneas celulares para la generación específica del paciente CM iPS derivadas.

Protocolo

1. Mantenimiento del alimentador-libre y Propagación de líneas de células humanas iPS

1. Preparar los platos revestidos con Matrigel. Descongelar un vial de matriz ESC-cualificado humana en hielo durante una hora y se diluye en 25 medio DMEM-F12 ml. Añadir 1 ml a cada placa de 35 mm (o cantidades equivalentes por unidad de superficie si se utilizan otros platos), manteniendo todo en hielo y asegurar que todas las placas y los tubos son pre-enfriado. Cubrir las placas con papel de aluminio.

Nota: las concentraciones de valores Matrigel variar según el lote. Instrucciones de dilución se indican en la hoja de datos.

2. Mantener las placas en hielo durante la noche y eliminar de hielo al día siguiente. Las placas se pueden mantener en la nevera durante hasta una semana antes de usar.
3. Preparar el medio completo mTESR1 (o descongelar un vial de medio Nutristem) y la H-ESM (medio de ESC humana) de acuerdo con la tabla de abajo.

   H-ESM	CONC FINAL	PARA 500 ​​ml
   Knockout sustitución Serum (KSR)	20%	100 ml
   GlutaMAX 100X	2 mM	5 ml
   MEM aminoácidos no esenciales	0,1 mM	5 ml
   La penicilina-estreptomicina	100 U / ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   2-mercaptoetanol	0,1 mM	900 l
   B27 Suplemento - sin Vitamina	1%	10 ml
   Suplemento N2	1%	5 ml
   Knockout DMEM	-	370 ml

   
   Medio de archivo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Para preparar el medio de crecimiento, se agrega FGF básico sólo beforla alimentación de correo a una concentración final de 20 ng / ml.

Nota: H-ESM completa condicionada a fibroblastos embrionarios de ratón se puede usar en lugar de mTESR1 o Nutristem de células iPS.

4. Colocar las placas recubiertas en un incubador a 37 ° C durante 30 min a 2 horas antes de pases.
5. Las células deben ser pasados ​​aproximadamente cada 5 días, incluso si no han llegado a la confluencia. Las colonias no deben tocarse.
6. Reemplazar medio de crecimiento con 1 ml de dispasa (1 mg / ml, se disuelven a partir de un mg / ml de caldo de 10 en PBS).
7. Retire diferenciar áreas con tirados pipetas Pasteur de vidrio. Las áreas que deben ser eliminados incluyen estructuras como cráteres o quístico en el centro de las colonias, y cualquier área donde las células se han separado de las colonias y aplanados y parecen estar migrando hacia el exterior.
8. Incubar a 37 ° C bajo una campana de cultivo hasta que las fronteras de colonias se vuelven más brillantes y comienzan a separar (por lo general alrededor de 5-7 minutos). Discard dispasa. Lavar con 1 ml de H-ESM y desechar.
9. En 1 ml H-ESM, use un elevador celular (espátula espátula) para colonias cosecha y recoger en un tubo de 15 ml Eppendorf. Enjuague con 1 ml H-ESM y añadir al tubo. Gira a 1.000 rcf durante 4 min y retirar el sobrenadante.
10. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de crecimiento pre-calentado (ya sea mTESR1 o Nutristem). Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y hacia abajo a menos de 6-8x. Determinar el número de células debe ser presentado y eliminar las células innecesarias (por lo general dilución 1:4 ó 1:5), por ejemplo para 2 placas a 01:05, eliminar 600 l, a continuación, añadir 1,6 ml de medio fresco.
11. Retire Matrigel a partir de placas. Las células de ubicación gota a gota, distribuir de manera uniforme sobre la placa. Evite agitar el tubo en exceso, ya que esto hará que las células se muevan hacia el centro.
12. Lave tubo con 1 ml de medio y se dividen entre las placas. El volumen final en cada placa debe ser de 1,5 ml de -2.
13. Cambio de medio cada día, excepto para el día después de pases. A pesar de que esideal para cambiar el medio todos los días, este puede ser cambiado de vez en cuando a una frecuencia de una vez cada dos días si han pasado más de 2-3 días desde el último paso sin afectar potencial de pluripotencia o diferenciación.
14. Si la línea celular debe ser congelado, volver a suspender en lugar de 1-2 ml de medio de congelación mFreSR utilizando una pipeta y colocar 2 1 ml / criovial. Viales lugar en una Caja criogénica a -80 ° C y la transferencia de nitrógeno líquido en 3-4 días.

Nota: Manual microdisección de células iPS debe realizarse bajo un microscopio estereoscópico. Un (FIV) estación de trabajo en la fertilización in vitro (por ejemplo, una estación de trabajo de FIV Ksystem) integrado con un estereomicroscopio permite la manipulación de las células en condiciones estériles, mientras que se mantienen en un área de superficie calentada. Si esto no está disponible, un microscopio estereoscópico se puede mover bajo una campana de flujo laminar regular.

2. Cuerpos embrioides Agregación y Cardiac Induction

1. Prepara-20 EBM medio de acuerdo con la siguiente tabla.

   EBM-20	CONC FINAL	PARA 500 ​​ml
   Suero Bovino Fetal (origen América del Sur)	20%	100 ml
   Aminoácidos no esenciales MEM	0,1 mM	5 ml
   La penicilina - estreptomicina	100 U - 0,1 mg / ml	5 ml
   GlutaMAX 100X	0,1 mM	5 ml
   2-mercaptoetanol	50um	450 l
   DMEM/F12	-	385 ml

   
   Uso de FBS de origen América del Sur es crítico para la determinación de la eficiencia de diferenciación: el empleo de otros tipos de sueros puede afectarel proceso de diferenciación. Para preparar un EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA) a una concentración final de 50 g / ml. Medio de crecimiento completo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de una semana.
2. Cosecha iPS colonias como se describe anteriormente (pasos 1.6 a 1.9).
3. Resuspender suavemente en 1 ml EBM-20 con una pipeta de 2. Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y abajo no más de 2 a 3 veces, comprobando el tamaño de las colonias bajo el microscopio estereoscópico. Placa en placas de fijación ultra-bajas en proporción de 1:1 (por ejemplo, un plato de 35 mm, utilice 1 pocillo de una placa de 6 pocillos). Enjuague tubo con 1 ml EBM-20 y añadir al plato.

Nota: El tamaño de las colonias afecta el proceso de diferenciación, el control de la eficiencia y el momento de la inducción cardiaca. La agregación de EBs homogénea de tamaño se ha demostrado para reducir la variabilidad observada durante la diferenciación.

4. El día 3, cambie EBM-20 una vez que el uso de un microscopio para evitar volver aremoción de EBS. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa, y retire medio.
5. En el día 7, el interruptor de EBs a placas recubiertas con 0,1% de gelatina y se coloca previamente a 37 ° C durante 30 min. Si es necesario, la gelatina se puede quitar y placas se dejaron bajo una campana de cultivo de células S / N. Añadir 35-40 CE por placa de 35 mm.
6. Compruebe EBS por golpear a las zonas y el cambio EBM-20 dos veces por semana. Marque donde se encuentran las zonas batiendo en la parte superior de la cubierta de plato, para facilitar que la localización bajo el microscopio estereoscópico. Áreas contratantes deben aparecer después de unos 10 a 20 días.
7. Cuando las áreas con contracción espontánea aparecen, cambian a medio y EBM-2 (preparar como EBM-20, con un 2% de SFB en su lugar) y aíslan como se describe a continuación en la sección 3.
8. Continúe revisando otros ámbitos por golpear y cambiar medio dos veces por semana hasta que se necesitan áreas batiendo para experimentos adicionales.

Nota: la eficiencia del proceso de diferenciación es altamente dependientevarios factores, el más importante de los cuales son las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizadas para inducir la diferenciación cardiaca. Para obtener el máximo rendimiento, las líneas celulares de prueba para posibles cardiomiogénico y varios lotes de suero.

3. Vencer a las áreas de aislamiento y Cultura

1. Recubrir las placas de 12 pocillos (4 cm ²⁾ o las placas de interés, con 5 mg / cm ² fibronectina, diluido en PBS para hacer un volumen suficiente para cubrir toda la superficie por completo (300 l total por pocillo en placas de 12 pocillos). Mantenga descubierto en campana de cultivo de células y dejar secar. Las placas pueden ser envueltos y se almacenaron a 4 ° CO / N.
2. Retire área usando un vaso superando sacó pipeta Pasteur y el bisturí, según sea necesario. Transferencia a placas recubiertas con fibronectina con una pipeta de 1 ml.
3. Añadir 1 ml EBM-2.
4. Tacha la placa para indicar las áreas en las que se eliminaron las células y cambiar el medio. Las placas se pueden mantener durante un máximo de 1 mes, ya que otras áreas pueden empezar a bcomer más tarde.

Nota: Si se necesitan grupos pequeños golpeando, pipetear el área explantada arriba y abajo varias veces bajo el microscopio estereoscópico, hasta que se rompe en pedazos más pequeños. Esto dará lugar a racimos de unas pocas células latiendo (ver la película 3).

5. Cambio de medio dos veces a la semana hasta que esté listo para el análisis.

Nota: Los cardiomiocitos obtenidos a partir de este protocolo poseen características morfológicas y funcionales del feto-como; maduración hacia un fenotipo adulto-como se puede obtener mediante el aumento del tiempo en cultivo para diferenciar aún más estas células.

4. Soltero Vencer celdas de aislamiento y análisis

1. Escudo diapositivas 2-cámara (4 cm Área ²⁾ u otros soportes adecuados con 5 g / cm ² fibronectina diluido en PBS suficiente para cubrir toda la superficie de cultivo. Si se utiliza un soporte de vidrio, la capa con la laminina y la fibronectina (5 g / cm ^{2 cada uno).}
2. Retire área batiendo con una pipeta Pasteur / bisturí de las placas de la sección 3.
3. Usando una pipeta de 1 ml, las células de transferencia a un tubo de 15 ml que contiene 500 l de colagenasa II (480 U / ml en PBS con Mg y Ca) y se incuba 15 min a 37 ° C, agitando el tubo una vez durante la incubación.
4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200. Si cualquier grupo permanecen, traslado al fresco colagenasa II y repita el paso 4.3.
5. Repita el paso 4.4 hasta que no haya grumos grandes se quedan.
6. Desactivar la colagenasa con 3 ml EBM-2 (sin AA). El tubo se puede dejar bajo el capó de un estante calentado hasta que otros tubos están listos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
7. Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluido a partir de un stock de 0,5% en 1X PBS) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Se combinan las fracciones de digestión de la misma muestra inicial.
8. Inactivar la tripsina con 4 ml EBM-2 (sin AA). Pasar las células a través de una aguja 18G en una jeringa de 2,5 ml no más than de 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
9. Resuspender el sedimento celular en 1 ml EBM-2 por pocillo y la placa. Las células se pueden utilizar para los análisis funcionales y morfológicas 2-3 días después de la siembra.

Resultados

En nuestros estudios hemos generado los CM de varias líneas de células iPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa de alimentación MEF pero se colocaron inmediatamente en Matrigel usando un medio definido (ya sea mTESR1 o Nutristem). Varios ensayos se utilizaron para verificar el mantenimiento de las propiedades morfológicas, la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, SSEA4 y TRA1-60) y su estabilidad genoma (Figura 1).

La inducci...

Discusión

Las células madre pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse espontáneamente en los CM, aunque con baja eficiencia y alta variabilidad entre líneas. Por consiguiente, el desarrollo de métodos de inducción novedosos se ha centrado en la mejora de la eficiencia del proceso y avanzar hacia protocolos más definidos. Sin embargo, la mayoría de estos nuevos métodos de diferenciación son bastante complejos, que requieren condiciones elaboradas cultura, control preciso del tiempo y la concentración de los reac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon