כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Summary

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

Abstract

גליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בבעלי חיים בעלי חוליות וממלאים תפקיד מכריע בחילוף חומרים בגוף כולו, כמו גם בחילוף חומרים תאיים. שיטות רבות לאיתור גליקוגן כבר קיימות אבל רק מעטים הם כמוני. אנו מתארים כאן שיטת שימוש בערכת assay Abcam גליקוגן, אשר מבוססת על השפלה ספציפית של הגליקוגן לגלוקוז על ידי glucoamylase. גלוקוז אז במיוחד חמצון למוצר שמגיב עם חללית OxiRed לייצר הקרינה. כותרות היא מדויקות, רגישה ויכולות להיות מושגת על תמציות תא או חלקי רקמות. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות, זה לא נותן מידע על ההפצה של גליקוגן בתאים. כדוגמא לטכניקה זו, שאנו מתארים כאן טיטרציה של גליקוגן בשתי שורות תאים, CCL39 פיברובלסטים ריאות אוגר הסיני וLS174 קרצינומה של המעי הגס האנושי, מודגרות בnormoxia (O 21% ₂₎ לעומת היפוקסיה (1% O _2). חוקרים שערנו כי היפוקסיה היא signal שמכין תאים לסנתז וגליקוגן חנות על מנת לשרוד ^1.

Introduction

גליקוגן הוא פולימר multibranched של שאריות הגלוקוז, אשר שוהה בציטופלסמה של סוגי תאים רבים. זוהי אחת הצורות העיקריות של אחסון אנרגיה בתאים וממלא תפקיד חשוב בחילוף חומרים של הגלוקוז. רוב תאי היונקים מסוגלים לייצר וגליקוגן חנות, אשר יכול להיות מושפל במהירות לגלוקוז כדי לקדם את ייצור גליקוליזה ו-ATP בלחץ מטבולים. Hepatocytes לייצר כמויות מסיביות של גליקוגן כדי לווסת את רמת הסוכר בדם ובכך לספק אספקה ​​רציפה של גלוקוז בגוף. לעומת זאת, הריכוז של גליקוגן בתאים אחרים (שרירים, תאי דם אדומים, וכו ') הוא נמוך יחסית. עם זאת, באופן מקומי, כמויות אלה מספיקות כדי לספק אנרגיה בטווח הקצר, כאשר התאים נחשפים פתאום לסביבה המקופחת של חומרים מזינים.

סינתזה של גליקוגן ופירוק גליקוגן כדלקמן את אותם צעדים בכל הרקמות (איור 1). ראשית, גלוקוזנכנס לתאים על ידי מובילי גלוקוז (עודפים), ומומר במהירות מglucose-6-phosphate (G6P) לגלוקוז-1-פוספט (G1P) על ידי phosphoglucomutase. G1P הוא שונה אז לUDP-גלוקוז, וC1 הפחמן של UDP-גלוקוז מחובר לשאריות טירוזין של glycogenin, חלבון העיגון של גליקוגן. מולקולה זו, הנחשבת לפריימר הגליקוגן, הוארכה על ידי צירופה של UDP-גלוקוז לגלוקוז המסוף ידי α (1 → 4) איגרות חוב באמצעות synthase הגליקוגן. לבסוף, כאשר שרשרת ליניארית של מעל 11 שאריות הגלוקוז נוצר, אנזים ההסתעפות מעביר oligosaccharide מסוף היווה ידי מינימום של 6 שאריות גלוקוז לגלוקוז אחר של השרשרת סמוכה באמצעות הצמדת α (1 → 6). חזרה על התהליך הזה נותן מבנה פרקטלית מאסיבי המכיל ענפים היוצרים סליל עם 6.5 גלוקוז בכל תור. הגליקוגן יכול להיות reversely הידרוליזה לגלוקוז על ידי הפעולה מתואמתשל debranching אנזימים שhydrolyze α (1 → 6) מחויב וphosphorylase גליקוגן שhydrolyzes α (1 → 4) glycosidic כבול בין השאריות האחרונות של גלוקוז של סניף ומולקולת גליקוגן. תגובה זו נקראת "גליקוגנוליסיס מופעלת על ידי הגדלת רמות של AMP (המשקף את צריכת ה-ATP), ומעוכבת על ידי גלוקוז ו-ATP ^2,3.

על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, מולקולות גליקוגן תוארו בסוגי תאים רבים חלקיקי β כבחינם (או monoparticles גליקוגן) של 15-30 ננומטר בקוטר. בסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes, ניתן להרכיב חלקיקי β למורכבים ליצירת רוזטות, הידוע גם בחלקיקים α המשתנות בקוטר מ 80 ננומטר עד למקסימום של ⁴ 200 ננומטר . דרך חלקיקי β אלה ערובה ליצירת צבירים גדולים יותר של חלקיקי α עדיין לא הובהרה במלואו. כמה ראיות נוטה להוכיח כי יכולים להיות קשורים חלקיקי β ידי מליטה קוולנטיים ^5, מליטה מימן, או אפילו דרך אינטראקציות בין חלבונים ^6. כמות הגליקוגן מאוחסן בתאים תלויים בפרמטרים רבים: (i) הסכום של glycogenin בתא שיוזם סינתזת הגליקוגן (ii) את הפעילות של synthase הגליקוגן וphosphorylase מוסדר על ידי זירחון חלבון / dephosphorylation; (שלישי) את הריכוז של גלוקוז בתאים, שהוא תלוי במספר פרמטרים כגון אספקת הגלוקוז ממערכת כלי הדם וספיגת הגלוקוז על ידי תאים. מאגרי הגליקוגן מוסדרים בחוזקה על ידי הרגולציה allosteric של הורמוני biosynthetic דרך מטבוליטים ביניים, על ידי הורמונים המסדירים את חילוף חומרים של אנרגיה, ועל ידי מסלולי איתות חישת מזין ^7.

חשוב להיותמסוגל לכמת גליקוגן בדגימות ביולוגיות כדי להבין את החשיבות של חילוף חומרים של הגליקוגן בגוף כולו והרמה תאית טוב יותר. אנו מתארים כאן ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה בassay חוץ גופית לגליקוגן. טכניקה זו מבוססת על הקרינה גלוקוז הכימות לפני ואחרי הידרוליזה ספציפית של גליקוגן.

שיטות אחרות קיימות כדי להעריך את הרמה של גליקוגן בתאים, אבל רובם הם לא כמוני. אחת הטכניקות הראשונות שתוארו לכימות של גליקוגן בתאים התבסס על מדידת התאגדות ^[14 C]-גלוקוז לגליקוגן ^8,9. השימוש בקרינה רדיואקטיבית עושה את התהליך הזה קשה יותר להתמודד אבל יש לו את היתרון של מתן שיעור התאגדות גלוקוז לגליקוגן ולהבחין בין ההפצה של שאריות הגלוקוז על הענפים החיצוניים ובליבה של המולקולה (זה גם דורש β-amyloly נוסףאחותי וצעד chromatographic). טכניקה נוספת שפותחה לאחרונה והוא מבוסס על השילוב של 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-י.ל.] אמינו}-2-deoxyglucose), נגזר 2-deoxyglucose ניאון, לגליקוגן ^10. עוצמת הקרינה שנמדדה משקפת את כמות הגליקוגן מיוצרת וניתן למדוד עם קורא הקרינה. הפצה של הקרינה בתא גם יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal.

בין טכניקות nonquantitative האחרות, מכתים תקופתי חומצה שיף (PAS) הוא אולי הנפוץ ביותר. ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי של גליקוגן בתאים קבועים, קטעי רקמה בפרפין או קפואים. צבעי טכניקה היסטולוגית זה לא במיוחד סוכרים, glycolipids, גליקופרוטאינים, תאית וmucins הניטרלי בסגול. הסגוליות של בדיקה זו יכולה להיות מוגבר על ידי טיפול בתאים קבועים או חלקי רקמות עם diastase, שדווקא מעכל גליקוגן. לאחר מכן,רמת הגליקוגן ניתן לאמוד באופן איכותי על ידי השוואת דגימות unhydrolyzed (כל מקרומולקולות הפחמימות שונה) לדגימות שעברו הידרוליזה (פחמימות שונה מקרומולקולות מלבד גליקוגן). צביעת PAS וניתוח מיקרוסקופי, בניגוד למבחנים ביוכימיים של גליקוגן, מספק מידע בנוגע להפצה של גליקוגן בתאים, אשר יכול להיות מפוזרת או מרוכזת בחלק מסוים של התא. עם זאת, אף על פי שהבדלי הערכות צביעת PAS בהצטברות גליקוגן בין תנאים שונים, זה לא כמוני ^11.

נוגדן חד שבטי עכבר במקור נעשה באמצעות סחוס condylar mandibular כאנטיגן הוכח להגיב בגליקוגן בתאים ועם גליקוגן מטוהר במבחנה ^12. כנוגדן זה דווקא מכיר בשרשרות סוכר הקשורות לגליקוגן, זה הוא כלי שימושי לזיהוי של הגליקוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באופן ספציפי יותר מאשר צביעת PAS.

במיקרוסקופ אלקטרונים הוא טכניקה נוספת שמאפשרת הדמיה של דגנים של גליקוגן בתאים והערכה של מידת אחסון גליקוגן. למעשה, חלקיקי β גליקוגן הם קל לזיהוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים כגרגרים צפופים אלקטרון ^1.

Protocol

כותרות ביוכימית של גליקוגן

1. תמוגה תא

1. תאי זרע בריכוז של 0.5-2 x 10 ⁶ לכל 100 צלחת בקוטר מ"מ.
2. טיפול: דגירה תאים 24, 48, או 72 שעות בריכוז הנמוך של חמצן (היפוקסיה) בתחנת באג-Box אנאירובי עבודה (הטכנולוגיה Biotrace Plc Ruskinn הבינלאומי, Bridgend, בריטניה) נקבעה על 1% או 0.1% O _2, 94% או 94.9% N _2, ו 5% CO _2. במקביל, תאי דגירה בnormoxia (21% O _2, CO ₂ של 5%). שנה בינונית (מדיום המכיל גלוקוז 25 מ"מ) בכל שעה 24 כדי למזער את השינויים בריכוז הגלוקוז בתקופת הניסוי.
3. לאחר טיפול, תאים לשטוף 2X עם PBS להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום לתרבות. לגרד את התאים בקור PBS.
4. צנטריפוגה הפתרון ב1,000 סל"ד במשך 5 דקות, לבטל את supernatant לשטוף את הכדור פעם אחת עם PBS. גלולה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך הלאה.
5. Resuspend את הכדור במים מזוקקים 100 μl. הוספה של גליקוגן הידרוליזה הצפת 100 μl מסופק עם גליקוגן ערכת Assay (Abcam). מרתיחים את lysate ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית אנזימים.
6. וורטקס ו צנטריפוגות lysate ב13,000 סל"ד 10 דקות כדי להסיר את המוצרים לא מסיסים. שמור את supernatant.
7. לנרמל רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין דגימות, כימות של חלבונים ניתן לעשות עם 25-35 μl של supernatant באמצעות assay Bicinchoninic חומצה (BCA-Interchim).

חלק מlysate ניתן להשתמש כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז החופשי בתוך התאים.

2. הידרוליזה של גליקוגן

1. מערבבים 50 μl של supernatant (שלב 1) עם 1 μl של הידרוליזה אנזים המיקס. תערובת זו מכילה glucoamylase. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
2. הכן את עקומת הכיול על ידי דילול גליקוגן הסטנדרטי (2 מ"ג / מיליליטר) שלupplied עם הערכה לפתרון של 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר הידרוליזה. בשלב הבא, להכין שישה צינורות נפרדים עם 0, 4, 8, 12, 16, ו20 μl של 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטנדרטי ולהתאים את כל צינור לנפח סופי של μl 50 עם חיץ הידרוליזה לתת ריכוז של גליקוגן של 0, 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, ו0.2 מיקרוגרם / מיליליטר. הוסף 1 μl של הידרוליזה אנזים מיקס בסטנדרטים ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.

ריכוז הגלוקוז ברקע של הקו הסלולרי, שניתן על ידי ערך עבור ריכוז גלוקוז החופשי, זה חייב להיות מופחת הערך לריכוז המוחלט גלוקוז (גלוקוז מהידרוליזה גליקוגן + חופשי גלוקוז) כדי לקבוע את הרמה של גליקוגן בתאים.

3. פיתוח וקריאה של הקרינה

1. עבור כל תנאי, להכין צינור אחד (צינור 1) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז חופשי ושני צינורות (צינורות 2 ו -3) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז בסך הכל (כל שנינות צינורחה נפח שונה של גליקוגן שעבר הידרוליזה).
2. הוסף 15 μl של supernatant שחולץ בסופו של שלב 1 בצינור 1. הוסף 35 μl של חיץ הידרוליזה כדי להשלים לנפח סופי של μl 50. הקרינה המתקבלת תיתן את הריכוז הגלוקוז בחינם.
3. הוספת μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה (שהושג בשלב 2) בצינור 2. להסתגל לנפח סופי של μl 50. נפח דגימה (X μl) צריך להיות מותאם על פי צפיפות תאים ו / או סוג תא על מנת לקבל ערכי הקרינה שאינם מעבר לריכוזים של עקומת הכיול.
4. הוסף 2 μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה בצינור 3. להסתגל לנפח סופי של μl 50.
5. הכן פתרון פיתוח לדגימות ולתקנים על ידי ערבוב לכל צינור 48.7 μl של פיתוח מאגר, μl 1 של פיתוח אנזים מיקס ו0.3 μl של OxiRed Probe (מסופק בערכת Assay גליקוגן). לדוגמא, עבור 2 תנאים, להכין תערובת לצינור 12s (6 לסטנדרטים, 2 לגלוקוז חופשי ו4 לסך הקרינה גלוקוז).
6. הוסף 50 μl של תערובת זו על צינור אחד ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
7. למדוד את הקרינה באורך גל עירור של 535 ננומטר, אורך גל פליטה של ​​587 ננומטר כפי שהומלץ, וחריץ של 3 ננומטר לעירור ופליטה.

תוצאות

רמה נמוכה של חמצן (היפוקסיה) באותות גידולים לתאי גידול את הצורך לאחסן אנרגיה כדי להתמודד עם דלדול מזין שלאחר מכן, כדי לשרוד. כגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים, שחקרנו את ויסות אחסון הגליקוגן בהיפוקסיה. החישוב וסטנדרטיזציה של הריכוז של גליקוגן ...

Discussion

טיטרציה ביוכימית של גליקוגן במבחנה מאפשרת כימות מדויק של תוכן גליקוגן בתאים. השוואה לכמה טכניקות אחרות (PAS, immunofluorescence עם נוגדן גליקוגן, וכו '.), טיטרציה זו היא ספציפית מאוד, רגישה ושחזור. יתר על כן, השיטה היא נוחה שכן הוא לא דורש רדיואקטיביות אבל ספקטרומטר הק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B