Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Riepilogo

Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all'interno di sezioni di tessuto.

Abstract

La spettrometria di massa di imaging (MSI) fornisce informazioni non mirata molecolare con la più alta specificità e la risoluzione spaziale per studiare i tessuti biologici presso le centinaia a decine di scala micron. Quando eseguito in condizioni ambiente, pretrattamento del campione diventa inutile, semplificando così il protocollo mantenendo l'elevata qualità delle informazioni ottenute. Desorbimento ionizzazione elettrospray (DESI) è una tecnica MSI ambient spruzzo-based che consente il campionamento diretto di superfici all'aperto, anche in vivo. Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene rastered sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica 'distribuzione spaziale. La fedeltà dell'uscita DESI-MSI dipende dall'orientamento sorgente e posizionamento rispetto alla superficie del campione e l'ingresso spettrometro di massa. Qui, esaminiamo come preparare sezioni di tessuto per DESI iMAGING e condizioni sperimentali aggiuntive che influenzano direttamente la qualità dell'immagine. In particolare, si descrive il protocollo per l'imaging di sezioni di tessuto cerebrale di ratto da DESI-MSI.

Introduzione

L'imaging non mirati mediante spettrometria di massa facilita l'acquisizione delle informazioni chimiche per applicazioni di scoperta e ipotesi generatrice. Imaging mirata di una sostanza chimica nota di interesse, invece, può facilitare una maggiore sensibilità e selettività attraverso specifiche sviluppo del metodo. La spettrometria di massa di imaging (MSI) è più comunemente eseguito sui tessuti mediante MALDI, ¹ massa di ioni secondari spettrometria (SIMS), ² e tecniche di ionizzazione ambiente, comprese le desorbimento elettrospray ionizzazione (DESI), ³ ablazione laser-elettrospray ionizzazione (LAESI), ^{4, 5} e liquidi micro-giunzione-superficie di campionamento sonda (LMJ-SSP). ⁶ Nella MALDI e SIMS, i campioni devono essere fisicamente rimosso dal campione, e devono essere piatta e sottile, come vengono analizzati sotto alto vuoto. MALDI richiede rivestimento del campione con una radiazione di assorbimento di matrice, aggiungendo un ulteriore passo ed ingombrante per la preparazione del campione. SIMSha la più alta risoluzione laterale, ma il bombardamento con particelle altamente energetiche provoca vasta frammentazione molecolare. Pertanto, MSI con metodi ambient riempire una nicchia in cui l'analisi morbido con la preparazione del campione minimo è auspicabile. Tuttavia, ad oggi, tutti i metodi sono ancora limitate dal requisito di superfici piane campione.

DESI usa uno spray solvente pneumaticamente assistita carico diretto alla superficie del campione di desorbire e ionizzare analiti. ⁷ Il modello di lavoro per il desorbimento e la successiva ionizzazione da DESI è conosciuto come il "pick-up modello goccia". ^8-10 Le goccioline cariche primarie prodotta dalla sonda DESI collidono con la superficie, bagnandolo e formando un film sottile in cui l'analita viene sciolto da un meccanismo microextraction solido-liquido ⁸ Successivamente gocciolina collisioni provocano trasferimento di momento e decollo di gocce secondarie contenenti il materiale estratto dalla superficie . ^9,10 definitiva, gasioni di fase si ritiene di essere prodotto attraverso processi ESI-come dopo evaporazione di litio, i modelli di residui di carica o di altri modelli, ¹¹ tuttavia il processo di formazione di ioni preciso in DESI deve ancora essere provata sperimentalmente. sensibilità ¹² DESI è fortemente dipendente dalla solubilità del dell'analita nel solvente spruzzo, come desorbimento basa sulla microextraction localizzata. ¹³

Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene analizzato unidirezionalmente con corsia passo sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica 'distribuzione spaziale (Figura 1). Dal momento che la prima prova di principio esperimento DESI-MSI riportato da Van Berkel e Kertesz, nel 2006, il ¹⁴ la tecnica è maturato notevolmente, ¹⁵ con le applicazioni riportate nella analisi dei lipidi, ^3,16 metaboliti delle droghe, ^17,18 diseÃsé biomarcatori, ¹⁹ tessuto cerebrale, ^3,18,20 tessuto polmonare, ¹⁸ tessuto renale, ¹⁸ tessuto testicolo, ¹⁸ ghiandole surrenali, ¹⁷ tavole cromatografia su strato sottile, ²¹ e superfici di alghe. ²² La risoluzione di routine di immagini ottenute da DESI-MSI è 100-200 micron, che è in ultima analisi determinati dalla superficie effettiva estratta dallo spray, ma sono stati riportati risoluzioni a partire da 40 micron. ^23-25 ​​Tale risoluzione e facilità di analisi rende DESI-MSI appropriato per l'analisi rapida e semplice di campioni biologici di tessuto con superfici in cm ² gamma 0.5-5, che consentono l'acquisizione di preziose informazioni territoriali per meglio comprendere i processi biologici ^26. Qui, come esempio di una tipica applicazione DESI-MSI, passiamo in rassegna i dettagli procedurali di condurre un esperimento di successo che coinvolge l'imaging dei lipidi nei tessuti cerebrali di ratto. Le due fasi più critiche del protocollo sono laPreparazione del tessuto ²⁷ e ottimizzazione della sorgente ionica DESI, come descritto di seguito.

Protocollo

1. Tessuto sezionamento

1. Negozio di flash-congelato, intero tessuto in freezer -80 ° C fino al momento per il sezionamento.
2. Permettere al campione di tessuto di raggiungere la temperatura nel cryomicrotome prima del sezionamento (30 min). Impostare la lama e la temperatura del campione a -30 ° C.
3. Una volta che il tessuto ha raggiunto la temperatura, la manipolazione del campione con pinzette, tagliare anteriore o posteriore del cervello seconda di quale parte del cervello è di interesse per sufficiente superficie di montaggio (cioè se la parte anteriore del cervello è di primaria importanza, montare posteriore del cervello sul mandrino).
   1. Applicare ~ 0,5 ml Temperatura ottimale di taglio Compound (OCT, Tissue-Tek, Sakura) al mandrino in centro e, con una pinzetta, tenere campione in vigore in ottobre fino a che non si solidifica. Una volta che ottobre è completamente congelato, montaggio mandrino a supporto del campione.
   2. Una quantità minima di ottobre utilizzato per montare il campione è preferito (in contrasto con il montaggio del campione in un blocco di ottobre come viene comunemente fatto in altri istoprocedure logiche) per minimizzare la contaminazione del campione. Contaminazione del campione da ottobre è dannoso per la DESI e processo di imaging a causa di soppressione ionica.
4. Sezioni tipo di tessuto necessari per l'imaging gamma MS 12-18 micron di spessore. Sezione tessuti a spessore desiderato entro il range raccomandato. Scongelare-montare ogni tessuto sezionato leggermente toccando una stanza a temperatura microscopio vetrino sopra sezione. Una volta che un campione è montato, fare attenzione a non toccare la sezione di tessuto, come cambierà la distribuzione chimici e composizioni.

Nota: si consiglia il montaggio di due sezioni per vetrino, con una sezione per l'ottimizzazione e l'altro per l'imaging. Se le sezioni non sono per l'imaging immediata, conservare i vetrini a -80 ° C freezer in una scatola di presentazione fino al momento dell'analisi.

5. Se l'analisi sezioni memorizzate, rimuovere diapositiva dal freezer, trasferire immediatamente a essiccatore a vuoto, e permettere ~ 15-20min per scongelare. Lasciando il campione in un essiccatore più si asciuga il campione e ridurre l'efficienza DESI. L'ottimizzazione della sorgente di ioni DESI verrà fatta con il campione di tessuto una volta scongelato, tuttavia, nell'interesse di tempo, il periodo durante il quale il campione si scongelano serve come un tempo ideale per l'inizializzazione dell'apparecchiatura.
   1. Usando acetonitrile con 1% di acido acetico come solvente DESI, accendere la pompa a siringa con un flusso di 5 ml / min. Una portata minore ridurrà il lato punto d'impatto del getto DESI e dimensione effettiva dei pixel, ma un flusso maggiore può essere necessaria per una sensibilità sufficiente. Quindi la portata (tipicamente 1-5 microlitri / min) deve essere ottimizzata per ogni applicazione e la sensibilità e risoluzione desiderata. Assicurarsi che la siringa contiene abbastanza solvente per l'ottimizzazione completa e di imaging in data portata.
   2. Una volta che il solvente appare gocciola dalla punta sorgente, accendere il gas azoto nebulizzazione con una prese di 160 psi.
   3. Accendere l'alimentatore ad alta tensione collegato alla sorgente di ioni applicando 3,600 V.
6. Montare il vetrino sul tavolo di movimento e iniziare a sorgente di ioni e MS ottimizzazione

2. DESI Ottimizzazione

1. Il sistema DESI composto da una sonda sorgente (vedere Figura 2), una siringa e pompa o sistema alternativo di erogazione del solvente, azoto compresso, il campionamento traduzione e montaggio. Procedere con l'ottimizzazione sorgente DESI una volta lo spettrometro di massa è stato ottimizzato per la gamma di massa appropriato e analiti di interesse.
   1. Se i componenti di origine non sono stati accesi ancora, fare riferimento alle sezioni 1.5.1-3 per le direzioni.
   2. Le variabili discusse in queste sezioni sono raccomandati per l'imaging di tessuti biologici. Tuttavia queste variabili devono essere ottimizzati per diversi tipi di tessuto o campione. Solventi alternativi, portate, nebulizzatori pressioni del gas e le tensioni sono state riportate per immaginazioneng di tessuti biologici. ^16-18
2. Assicurarsi che inizialmente la sorgente DESI non tocca il vetrino, e non indirizzati contro parti della sezione di tessuto. Questo assicurerà che la sonda non viene danneggiato nel processo di ottimizzazione iniziale e non contaminerà qualsiasi parte del set up entrando in contatto con il campione di tessuto.
   1. Una buona posizione di partenza è con il consigliato 3 mm dalla superficie del campione e di 5 mm dall'ingresso capillare MS, con la sonda ad un angolo di 55 ° rispetto alla superficie del campione. L'interno della sonda capillare DESI deve estendersi circa 1 mm oltre la capillare esterno. Tutti questi parametri saranno ottimizzate.
3. L'interfaccia MS capillare deve avere un angolo di raccolta di ~ 15 ° rispetto alla superficie del campione per il trasferimento ottimale di ioni. Regolare l'altezza stadio in modo che il MS libra capillari sulla superficie del campione, il capillare deve essere <1 mm dalla superficie, il più vicino possibilesenza toccare.
4. Allineare la sonda DESI nella dimensione x con rispetto all'aspirazione capillare MS modo che siano direttamente in linea.
5. Regolare le posizioni yez della sorgente DESI per sensibilità ottimale utilizzando la sezione di tessuto supplementare. Si noti che, come la sonda DESI è diretto a una zona campione, finirà desorbire e ionizzare tutti gli analiti in quella zona e segnale diminuirà gradualmente come questo avviene. Esegue questo punto il più rapidamente possibile è importante.
   1. Pertanto, durante il processo di ottimizzazione, il campione deve essere spostato sotto la testa di spruzzo di garantire che campione fresco viene analizzato e che eventuali variazioni di segnale sono dovute alla ottimizzazione della sorgente, non campione esaurimento. Tuttavia, considerando che la variegata composizione chimica delle diverse regioni del tessuto, un confronto diretto dell'intensità ionico attraverso l'intera sezione di tessuto non è del tutto preciso. Il talamo del cervello fornisce un'area abbastanza grande dimensioni concomposizione chimica più consistente, ma ancora non perfettamente uniforme. Alternativamente, una marcatura di pennarello rosso, che contiene il colorante rodamina 6G ([M] ^+, m / z 443), sul vetrino lontano dal campione fornisce una forte risposta da MS DESI e può essere utilizzato anche per l'ottimizzazione, ma data la forma campione diverso e analita, queste condizioni possono ancora non correlare ad un set-up ideale per i tessuti biologici.
   2. Separazione y consigliata tra la punta e la fonte di aspirazione capillare: ~ 4 mm separazione z raccomandato tra la punta e la superficie del campione: ~ 1,5 mm. Anche se questi parametri saranno leggermente diverso per ogni set-up sperimentale.
   3. Considerando la geometria e l'angolo della sonda, tenere conto che la ye z posizioni-dimensionali sono correlati rispetto alla trasmissione efficace delle goccioline solvente e contenenti analita. Un cambiamento di una variabile richiede una modifica successiva nell'altro per mantenere la stessa posizione impatto spruzzo esuoi angoli trasmissione.
6. Regolare la distanza delle estrusioni capillari interni dal capillare esterno della sorgente per la massima sensibilità, e il minimo impatto dimensione dello spot. Attenzione: assicurarsi che l'alta tensione è OFF Durante questa regolazione.
7. La geometria di origine è considerato ottimale quando si osserva il massimo del segnale.
   1. Le variabili ottimizzati nelle sezioni 2.5-2.6 sono collegati tra loro, pertanto la regolazione potrà inerentemente richiedono la ri-regolazione dell'altro per mantenere la geometria necessaria sorgente-campione-aspirazione, o regolazione delle condizioni discusso nella sezione 1.5.1- 3.
8. Inoltre, un elemento riscaldante che circonda il trasferimento capillare allo spettrometro di massa può migliorare la sensibilità facilitando desolvatazione delle goccioline analiti cariche prodotte durante il processo di ionizzazione. Qui si usa un riscaldatore corda arrotolata intorno al trasferimento capillare impostato a 100 ° C.

3. Tissue Imaging

1. Durante il processo di imaging, la fase di campionamento il campione si muove sotto la sonda DESI e MS aspirazione capillare e tutti gli altri componenti rimangono stazionari. I parametri di movimento della fase dovrebbero essere selezionati sulla base DESI impatto dimensioni pennacchio e sensibilità ottimale.
   1. Un pennacchio impatto maggiore si tradurrà in una maggiore intensità di ioni, dato che più campione viene desorbita, però per l'imaging, sarà anche tradursi in una dimensione di pixel maggiore e quindi peggiorare risoluzione dell'immagine.
2. La piattaforma di traslazione utilizzato in questo esperimento è home-costruito e controllato da un programma LabView che permette il controllo della velocità e interlinea rastering per un'immagine di dimensioni date. La fase VI il controllo del movimento utilizzato in questo esperimento è disponibile presso omnispect.bme.gatech.edu. In alternativa, una sorgente DESI disponibile in commercio e la fase potrebbero essere utilizzati come l'automatico Omni Spray fonte 2D da Prosolia Inc. (Indianapolis, IN, USA).
   1. Per i tessuti cerebrali di undimensione tipica immagine è di 10 x 15 mm, e dati i parametri di movimento palcoscenico utilizzati, l'immagine richiede circa 3 ore.
      1. Programmare il VI di LabVIEW o software di controllo equivalenti per le condizioni di imaging desiderati, utilizzando una velocità di fase di scansione di 80 micron / sec, e l'interlinea tra le file di 200 micron. Quando si utilizza la sorgente Spray Omni, i parametri di movimento devono essere impostati per una velocità di scansione di 100-200 micron / sec e una spaziatura di 200 micron. Notare che questi parametri di movimento possono essere modificati a seconda del numero di pixel desiderati in ciascuna dimensione sensibilità e necessario.
         1. Una interlinea più piccola ha dimostrato di migliorare la qualità dell'immagine, con la velocità di scansione avente un effetto minore. ²⁵ Tuttavia, è significativo notare che questo non indica necessariamente e migliore risoluzione dell'immagine, dato che è fortemente dipendente punto d'impatto dimensione. Una velocità di scansione più lenta e l'interlinea minore aumenterà in modo significativo il tempo di analisi e devono quindi essere ottized per ogni tipo di tessuto o campione.
      2. Con l'acquisizione spettrale MS impostato a 1 scan / sec, e l'immagine creata come 1 pixel / scansione, la velocità di fase definisce la dimensione dei pixel nella dimensione x, mentre l'interlinea determina la dimensione dei pixel nella dimensione y. Anche se la vera dimensione in pixel dell'immagine è più grande di questa causa di spruzzare la diffusione, più lento movimento permette più tempo per desorbimento e la rilevazione di analiti.
   2. Dare directory e il nome del file per i file di posizione e di tempo per essere registrati durante le immagini all'interno del VI di LabVIEW.
3. In preparazione per l'acquisizione dati di spettro di massa, calcolare il tempo totale necessario per l'imaging. Il programma Labview utilizzato dal nostro gruppo fornisce automaticamente questo valore, ma se viene utilizzato controllo alternativo stadio, questo calcolo è necessario per le impostazioni di acquisizione dati MS.
   1. Quando si usa uno spray fonte automatizzato Omni e stadio, ogni linea dell'immagine viene acquisito come individuale corre. Il tempo-per-linea e il numero di linee necessarie per determinate dimensioni di imaging sono calcolati utilizzando il software di controllo Omni Spray da immettere nel software spettrometro di massa.
4. Verificare che la velocità di scansione spettrometro di massa è uno spettro / sec, e impostare il tempo di acquisizione dello strumento per abbinare il tempo totale calcolato.
   1. Impostare la velocità di scansione spettrale a 1 spettro / sec.
   2. Acquisire dati in modalità profilo e accertarsi che il campo di m / z è appropriato per le specie di interesse. Ricorda che DESI produce anche analiti moltiplicano cariche, come in ESI.
   3. Impostare il tempo di acquisizione in modo che corrisponda il tempo totale immagine data da LabView.
5. Posizionare il punto di impatto a spruzzo in alto a sinistra dell'area da acquisire.
6. Iniziare l'acquisizione dei dati di MS e di movimento palco contemporaneamente.
7. A conclusione dell'operazione di acquisizione dati, tornare spettrometro di massa in modalità standby.
8. Spegnere alta tensione di sorgente DESI.
9. Girare off gas azoto.
10. Spegnere pompa a siringa.

4. Elaborazione delle immagini

1. Dati spettrali di massa, in combinazione con il tempo di prova e dati di posizione salvati come file di testo tramite LabView devono essere "piegato" in un'immagine 2D correlando le coordinate del pixel con spettri corrispondenti. Le immagini qui presentate sono state elaborate utilizzando il software Matlab-based che è liberamente disponibile presso: omnispect.bme.gatech.edu. Se i dati sono acquisiti utilizzando la fonte Spray Omni, il software di conversione dati lucciola viene utilizzato per creare il cubo di dati per la visualizzazione dell'immagine in BioMAP (www.maldi-msi.org).
2. Per i dati acquisiti sul spettrometro di massa Jeol AccuTOF, il cromatogramma registrato deve essere esportato in formato. Cdf per ulteriori analisi.
   1. Utilizzando il DataManager entro MassCenter, prima convertire i dati acquisiti ai dati centroided (Strumenti → Converti dati acquistion al Baricentro). Quindi esportare i dati in formato. CDF utilizzando la combinazione di tasti Ctrl + Maiusc + E folseguita da Strumenti → Esporta.
3. Carica i dati grezzi. Cdf massa spettrali e le due file di testo, la posizione e il tempo, al sito OmniSpect. Dati di imaging Firefly-elaborati possono essere visualizzati in BioMAP.
   1. Ulteriore elaborazione dei dati tra cui l'analisi statistica di non-negativo Matrix Fattorizzazione o plottaggio di un singolo ione di interesse può essere effettuata direttamente sul sito web.
   2. In alternativa, il cubo di dati grezzi possono essere esportati per l'analisi in Matlab.

Risultati

La figura 3 mostra uno spettro rappresentativa risultante da una sezione di cervello di ratto non trattato. Nel modo positivo, lo spettro di massa è dominato da fosfatidilcoline causa delle loro elevate efficienze di ionizzazione (attribuire al gruppo di ammonio quaternario carica positiva). L'immagine complessiva ione della sezione di tessuto è anche mostrato in Figura 3, che mostra segnale abbondante attraverso l'intera sezione cervello. Lipidi chiave individuati sono identi...

Discussione

L'ottimizzazione della geometria sorgente DESI è critica per esperimenti MSI successo. Le molteplici variabili che contribuiscono alla allineamento del sistema influiscono direttamente sensibilità e risoluzione dell'immagine. Se durante l'ottimizzazione, lo sperimentatore ha difficoltà nell'ottenere il segnale, si consiglia di utilizzare macchia pennarello rosso disegnato sul vetrino come punto di riferimento, il colorante, rodamina 6G, m / z 443, produce un forte segnale in modalità ioni positivi e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface