3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

要約

この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。

要約

細胞遊走は、伝統的に、2D基板で研究されている。しかし、それは、問題の生理学的プロセスの次元に似て良い、より適切な3D環境での細胞遊走を研究する必要があることがますます明らかになっている。遊走細胞は、実質的に、彼らは2Dまたは3Dの基板上に移動しているかに応じてその形態と移行のモードで異なる場合があります。 3Dマトリックス内に埋め込まれた細胞のほとんどは標準プロトコル、構造及び機能解析と技術的な問題と互換性がないため、まだ珍しい​​のまま。この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞の移行のための適切なECM​​基板として、我々は、私は室温で重合し、蛍光共焦点顕微鏡の標準を使用して可視化を容易にするためのラベルnonpepsinizedラット尾コラーゲンを使用しています。この作品はまた、protocを含む内因性の細胞骨格の3D免疫標識OL。我々は、分子組成、ローカリゼーション、および3Dで細胞構造の機能のより良い記述に貢献したいと考えて、これらのプロトコルを使用する。

概要

細胞移動の分野では、ブランドの新しい三次元の世界に勇敢に立ち向かうされています。これは、最も近い3次元（3D）、したがって、生理1に似ており、環境内の細胞遊走を研究する直感的である。しかし、技術的な制限により、ほとんどの細胞遊走試験は、未処理又は適切な細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されたいずれかの剛体二次元（2D）基板を横切って細胞運動を解析することが行われている。

三次元コラーゲン格子において細胞遊走に捧げ最初の研究は20年以上戻って^1-3行く。ただし、過去5年間では遊走細胞が実質的にその形態や基板の次元に応じて、移行のモードで異なる可能性があることが明らかになった。 2Dで、細胞が広いだけで平坦突起の形成（葉状）、その結果、接着斑を使用して、腹面を有する基板に連絡彼らのリーディングエッジに埋め込まれた指状の突起（糸状仮足）。これらの構造体は、一緒に後縁へのセル前面を接続するストレスファイバーと、2Dで細胞運動のために重要であると考えられている。 3Dマトリックス中に、細胞が形成し、これらの構造の多くの機能的関連性にかなりの変化を引き起こし、ECMを接触全体細胞表面と、一般的に細長いある。逆に、他の細胞の機能は、このようなECMリモデリング⁴に関わる核変形や構造などの3D移行に関連性を得ることができます。

これらの既知の形態学的変化、ならびにECMおよび細胞型に応じて変化し得る^5-7移行モードの違いは、3Dマトリックス内に埋め込 ​​まれた細胞の構造的および機能的な解析にもかかわらず、依然として異常なままである。太く密3D行列の操作技術などの高解像度の顕微鏡イメージングなど困難、最も安定して非互換性を運ぶndardプロトコルは、内因性タンパク質の免疫蛍光ラベルのように、2次元文化のために最適化されています。 3Dマトリックスの使用は比較的新しいアプローチであるため、また、研究者は依然として密接な異なる組織器官の正常な間質アーキテクチャまたは腫瘍の周囲のECM組織として生体内の状況で特定の似ているように最高の条件を調査している。異なるグループに関する検索結果の矛盾は、例えば、癌細胞の遊走のモードや接着斑の存在は、いくつかの論争^8を生成した。多くの努力が最近ECM化学的性質、細孔径、繊維の太さ、およびマトリックス剛性の点で合意に達するために専念してきました。 3D ECMは多くの異なるタイプの現在市販されているマトリゲルに細胞由来のマトリックスを変化させ、使用されている、pepsinizedウシコラーゲンI、またはnonpepsinizedラット尾部コラーゲンI.は、これらの行列の各々は、特定の物理的および化学的性質を有し、相対する1つのニーズ検討されて生理的プロセスに最適なTEが行列。また、細孔径および繊維の厚さは、例えばpH及び温度^9,10等の重合条件に依存することができる。にとガラスのようなリジッド基板からの距離バインド、またマトリックス^10,11の弾性特性を変更することができます。

この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞スフェロイドの製造方法は、以前に、ハンギングドロップ法^12,13およびアガロースでコーティングされたプレート法^14、最も人気のあるものに記載されている。癌細胞の移動に適したECMの基板として、Iは室温で重合nonpepsinizedラット尾コラーゲンは2 mg / mlのに使用される。 Nonpepsinized酸抽出したコラーゲンラット尾から私は両方のN-およびC-末端テロペプチド、天然コラーゲンintermolecの責任コラーゲン分子のnonhelical部分を保持ウラル架橋とfibrilar安定性^15。併せて、これらの条件に最も近いインビボ ¹⁰ で観察されたものに似たコラーゲンネットワークの形成を可能にする。詳細なプロトコルは、蛍光5を用いたin vitro ¹⁰ 中のコラーゲンを標識するために設けられている固定および培養物中で生きている、コラーゲン繊維の視覚化を可能にする- （および-6） -カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、スクシンイミジルエステル。このプロトコルはBaici らから適応されています。フルオレセインイソチオシアネートは、水溶性のコラーゲン分子を標識するために使用されている^16,17。フルオレセインとして、TAMRAは、例えば、N末端の遊離アミノ基と、より重要なのは、リシンの側アミノ基のようなタンパク質のnonprotonated脂肪族アミノ基と反応するアミノ反応性蛍光色素である。リジンアミノ基がnonprotonated形態である場合、この反応は、塩基性のpHで起こる。 TAMRAに加えて上のフルオレセインよりも安定している時間は、その発光スペクトルは便利GFPタグ融合タンパク質の生細胞イメージングのために組み合わせることができ、赤/オレンジレンジ（EX / EM = 518分の555 nm）で、上に落ちる。アミノ反応性色素でラベルされた可溶性コラーゲン分子を使用すると、重合プロセスでも密度、細孔径とコラーゲンマトリックス^10,16,18,19の架橋状態には影響を与えません。

このプロトコルは、さらに細胞骨格や細胞骨格に関連するタンパク質を標識するために最適化された内因性タンパク質の三次元免疫ラベリングするための方法も含まれています。このプロトコルの最終的な焦点は、コラーゲンマトリックスの張力に硬質ガラス製カバースリップの低減に寄与共焦点顕微鏡を用いた3次元培養物の高解像度の画像を取得する方法である。

プロトコル

1。 TAMRA-コラーゲンIラベル

1. 供給25mgのTAMRA粉末に2.5ミリリットルのDMSOを加えることにより10 mg / mlのTAMRA溶液を調製。完全に溶解するまでボルテックスすることにより、それを溶かす。 -20ºCで保存し、光から保護します。
2. 標識バッファー（0.25 M NaHCO _3を 、0.4 M NaCl）を2Lのを準備します。 10 MのNaOH溶液を用いてpHを9.5に調整する。 4℃に保つ特に明記しない蛍光体は、アルミニウム箔を用いて光から保護されていない限り、この時点から、すべての操作は4℃で実施される。
3. 高度に濃縮されたラット尾コラーゲンI溶液1mlで1ミリリットル使い捨て注射器を埋める。高濃度のコラーゲン溶液は、典型的には10 mg / mlの濃度の周りに設けられており、非常に粘稠であるて​​いる。気泡の形成を避けるためにゆっくりとそれを操作してください。
4. 21 Gの皮下注射針を使用し、MWCOカットオフ10,000予浸3ミリリットル透析カセットにコラーゲンを注入する。玉を避けるために注意してください針で膜パトン。シリンジピストンを引き上げて透析カセットからすべての空気を除去する。ラベルバッファの1リットルに対して一晩、それを透析。
5. ラベルバッファの900μlの10 mg / mlのTAMRA溶液100μlを混ぜる。注：DMSOは4℃で凍るので、これは、室温でTAMRAソリューションとラベルバッファの両方で行う必要があります混合した後、4℃に希釈TAMRAソリューションを持ち帰る
6. 慎重に21 Gの皮下注射針で2ミリリットル使い捨て注射器を使用して透析カセットからコラーゲンを削除します。ピペッティングにより希釈TAMRA溶液1mlで透析コラーゲン溶液1mlを混ぜる。
7. 2 mlのマイクロ遠心チューブにコラーゲン/ TAMRAミックスを移し、回転で一晩インキュベートする。
8. 予浸3ミリリットル透析カセットにTAMRA標識コラーゲン2 mlを移し、自由色素の過剰を削除するには、バッファのラベリングの1 Lに対して一晩透析。
9. TAMRA-ラボを復元するには元のコラーゲン溶液にELEDコラーゲンは、0.2％のL 1（v / v）の酢酸溶液、pHが4の中に透析カセットを配置し、一晩透析する。
10. TAMRA標識コラーゲンの最終容積を測定し、使用されるコラーゲン溶液の初期体積と濃度を考慮して、最終的な濃度を計算。 4℃で保存

2。組込シングルセルで3D TAMRA-コラーゲンマトリックス

1. 実験のために必要な2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックスの体積を計算する。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。
2. 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。
3. 希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切な容量で10倍PBSと1NのNaOHを混ぜる。例えば、1 mlの最終容積のためにpH7.4でTAMRAコラーゲンミックスの、1N NaOHを5μlの10倍のPBSを100μlを兼ね備えています。よく混ぜる。
4. TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンと未標識コラーゲンの4.01 mg / mlのの415.71μlに90.48μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。
5. 10 ⁵細胞/ mlおよび2 mg / mlのコラーゲンの最終濃度の最終細胞密度を得るために、TAMRA-コラーゲンの組合せにすることなく冷却されたFBS細胞培地の適切なボリュームに懸濁した細胞を加える。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlのために、10 ^5個の細胞を含むメディアの388.81μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験の上でミックスを10μLをテストすることによって、pHを確認旅。
6. ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは30-45分間室温で重合することができます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。
7. 慎重にコラーゲン/セル滴をカバーするために十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。細胞がマトリックスに移行するための十分な時間（通常1-3日）を10％CO ₂の加湿空気中で37℃で保管してください。

3。組み込み細胞スフェロイドの3D TAMRA-コラーゲンマトリックス

1. 2 mg / mlのTAMRAコラーゲンMの体積を計算実験のために必要なIX。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。
2. 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。
3. 希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切なボリュームにFBSことなく10倍PBS、1 N NaOHおよび細胞培地を混ぜる。例えば、pH7.4でTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、10倍のPBS100μlを、1NのNaOH5μlのメディアの388.81μLを兼ね備えています。よく混ぜる。
4. TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンの90.48μlのとunlaの4.01 mg / mlのの415.71μLを追加beledコラーゲン。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験ストリップ上のミックス10μLをテストすることによって、pHを確認してください。
5. ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは2-5分間重合を開始することができます。これは、若干のゲル粘度を増加させることによりスフェロイドの沈み込みを防止するのに役立ちます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。
6. 細胞スフェロイドを収集し、クリーンなペトリ皿の上に置きます。液体の余分を削除し、TAMRAコラーゲンミックス10μlにそれを再懸濁します。これは、セルメディアとコラーゲンの希釈を防止することが重要である。
7. P20ピペットを用いて、コラーゲンは回転楕円体濁し、100μlのTAMRAコラーゲンミックスドロップの中央上部に置きます集める。注：彼らが侵入し、及び/又は移行する各他の容量に影響を与えることができるので、コラーゲンの低下ごとに複数の回転楕円体を置かないでください。
8. ポリにTAMRAコラーゲンミックスを許可する30-45分間室温でmerize。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。
9. 慎重にコラーゲン/スフェロイド滴をカバーするのに十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。
10. 細胞がマトリックスに侵入する/移行するための十分な時間（通常1-3日）のために、10％のCO ₂加湿空気中で37℃で保管してください。

4。 3D免疫蛍光染色

1. 慎重に細胞培地を除去し、PBSで細胞/スフェロイドを含むコラーゲンマトリックスをすすいでください。
2. 同時に抽出/固定液（4％PFA、0.3％トリトンX-100、PBの5％ショ糖でインキュベートすることによって固定し、細胞を抽出5分間S）。 2μMのファロイジンと細胞骨格や細胞骨格関連タンパク質の可視化のためのタキソール2μMでバッファを補う。
3. さらに、4％PFAで30分間、PBS中の5％スクロースで細胞を固定します。 0.05％PBS中のTween-20で洗い流してください。
4. PBS中で一次抗体溶液を調製。室温または一晩4℃で少なくとも1時間一次抗体で細胞をインキュベート全体のコラーゲンの低下をカバーするのに十分な解決策を追加してください。 35ミリガラスボトムディッシュのために、溶液1.5〜2溶液に必要であろう。注：抗体溶液の量を減らすために、例えばシリコーングリース又はPDMSリングの円周線と水不溶性障壁は、コラーゲン滴の周りに配置することができる。
5. 0.05％PBS中のTween-20で3回、30分間洗浄します。
6. アレクサ標識二次抗体を、PBS中アレクサ共役ファロイジン及びDAPI溶液を調製する。室温で2時間、適切な二次抗体で細胞をインキュベートする。
7. 3X 3を洗うのTween-20、PBS中の0.05％と0分。
8. 液体の過剰を取り除き、ガラスボトムディッシュ底（約500μL）を記入し、密封するために上部に24ミリメートルのカバースリップを置くために十分なマウントメディアを追加。コラーゲンの低下を圧縮し、3Dの組織の損傷を防ぐために、カバースリップを下に押さないでください。

5。サンプルイメージング

クラシックまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用することができます。反転されたシステムは、優先的にガラス下から撮像された細胞の距離を決定するために使用されるべきである。この作業のために使用されるシステムは40X/1.3NAと60X/1.4NA油浸対物レンズ（それぞれ距離は200μmと130μmのを、作業）、Photometrics CoolSNAP HQ2カメラ、1392 X 1040を搭載した倒立共焦点スピニングディスクですイメージング·アレイ、6.45 X 6.45μmのピクセルと変形者イメージングソフトウェアによって制御されます。 405nmで、491 nmで、561 nmであり、かつ633nmのレーザは、典型的には30〜50％のパワーで使用される、利得1および2のビニング露光時間を短縮すること×2。 、FITC（EXC 478から495;全角510から555）と、テキサスレッド（EXC 560から580;全角600;顕微鏡もDAPI（全角450から465 EXC 400から418 nm）のための水銀ランプとフィルターキューブが装備されている-650）アイピースで使用する。

1. 蛍光灯を使用した、コラーゲンの低下の中央に40X客観的に配置します。のx-y軸およびz軸の両方において、試料の概要を取得する。エッジ効果を避けるために、画像を取得する際のxy軸のゲル端から100μm以上を逸脱しないことを確認してください。ときイメージングスフェロイド、彼らが客観作動距離の下にあることを確認してください。必要に応じて目標を変更してください。
2. 共焦点ライブイメージングモードに切り替えます。 TAMRA標識したコラーゲンを可視化するために561 nmのレーザーを使用することにより、ガラスの底部から出発すると、コラーゲン繊維が現れ始めるれるzの値を決定する。これにより、基板底面およびz = 0である。
3. フォーカスノブを使用して、Z = 0から100程度まで行く。 Z = 100ミクロンでセルのみ以上硬質ガラス底から張力の影響を回避するために結像されるべきである。
4. イメージにセルを選択します。波長毎にカメラの露出時間とレーザパワーを最適化する。 DAPIおよびアレクサ488ファロイジンの典型的な露光時間は100〜200ミリ秒の間である。抗体染色のための露光時間は変わる場合があります。
5. フォーカスノブを使用して染色し、ファロイジンを可視化するための適切なレーザを用いた共焦点ライブモードでは、電流を上部と下部のzの値を設定することにより、zの系列間隔を定義する。
6. zのステップサイズを定義します。 40Xの目的のために、1ミクロンを使用しています。 60Xの場合、0.5μmのを使用しています。取得を開始します。

結果

TAMRAとラットテールコラーゲンIにラベルを付けると3Dコラーゲンネットワークの容易な作成と可視化を可能にします。 生体 ¹⁰ で見つかったものに匹敵する組織とコラーゲンネットワークの形成における室温結果でスロー重合。

ここでは、回転楕円体として単一細胞としても、CT26癌細胞の細胞骨格の免疫蛍光染色するためのプロトコルを提示...

ディスカッション

私はTAMRAを使用蛍光ラベルコラーゲンにここで説明するプロトコルは、561 nmのレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を使用することにより、コラーゲンネットワーク組織を簡単に可視化を可能にする優れた方法を提供します。反射率共焦点顕微鏡と比較して、この技術の利点は、三次元マトリックスに深く画像コラーゲン繊維の能力である。繊維反射の強度およびコントラストは、レー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane