Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Riepilogo

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Abstract

Embrioni metà della gestazione del mouse fase sono state coltivate utilizzando un mezzo di coltura privo di siero preparato da disponibili in commercio integratori multimediali cellule staminali in un sistema di coltura bottiglia di laminazione ossigenato. Embrioni di topo a E10.5 sono stati attentamente isolati dal dell'utero con intatta sacco vitellino e, in un processo che coinvolge manovra chirurgica precisione gli embrioni sono stati gentilmente esteriorizzato dal sacco vitellino, pur mantenendo la continuità vascolare dell'embrione con il sacco vitellino. Rispetto agli embrioni preparati con intatta sacco vitellino o con il sacco vitellino rimosso, questi embrioni esposti tasso di sopravvivenza superiore e progressione evolutiva quando coltivate in condizioni simili. Abbiamo dimostrato che questi embrioni di topo, quando coltivate in un mezzo definito in un'atmosfera di 95% O _2/5% di CO ₂ in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C per 16-40 ore, mostrano crescita e sviluppo morfologico paragonabile a gli embrioni in via di sviluppo in utero. Crediamo thè il metodo sarà utile per gli investigatori che hanno bisogno di utilizzare tutta la cultura dell'embrione per studiare le interazioni di segnalazione importanti nell'organogenesi embrionale.

Introduzione

In vitro metodi colturali che utilizzano embrioni integrali sono adatti a studiare meccanismi di segnalazione coinvolti nella organogenesi embrionale che sono altrimenti di difficile accesso in utero. Embrioni integrali forniscono l'integrità dei tessuti e un sostegno adeguato per le interazioni dei tessuti che sono cruciali per la tempestiva presenza di meccanismi di segnalazione essenziali per i diversi processi cellulari durante l'organogenesi. Mentre intere culture embrione di fornire una piattaforma per una pletora di applicazioni come gli studi di trapianto, manipolazioni genetiche e biologiche, studi tallone di impianto, gli studi tossicologici, ecc., Sistemi di coltura di embrioni attualmente utilizzati sono prevalentemente a carico del siero per la corretta crescita e il mantenimento degli embrioni nella cultura ^1-9.

Il siero è stato utilizzato come uno dei principali componenti che vanno dal 10-100% dei terreni di coltura ^{6-8, 10, 11.}, Tuttavia, la composizione del siero non è ben definito e può differire da un animale all'altro e ogni volta il siero viene raccolto. Mentre la preparazione del laboratorio di siero molto tempo e comporta procedure rigorose, siero procurato esibisce in commercio una notevole variabilità tra i diversi lotti e aumenta i costi sperimentali. In aggiunta a questi, il siero può contenere incognite, quali fattori di crescita, ormoni o altre proteine, che possono potenzialmente influenzare l'esito di alcuni esperimenti, in particolare quelli che riguardano lo studio di molecole di segnalazione importanti nelle interazioni tissutali. Studi hanno dimostrato che l'aggiunta di siero di cultura può potenzialmente alterare i livelli intracellulari di alcune molecole di segnalazione come adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e proteine ​​coinvolte nella segnalazione mitogenico e phosphoinositide 3 (PI 3)-chinasi vie di segnalazione ^12-14. Contrariamente a questi, un sistema esente da siero fornisce i vantaggi di ambiente antigene libero,astinenza da enzimi biologicamente attivi che possono alterare i processi cellulari e permette la coerenza tra esperimenti.

Nel presente studio, abbiamo utilizzato un mezzo di coltura privo di siero preparato da integratori multimediali cellule staminali disponibili in commercio per cultura stadio intermedio di gravidanza embrioni interi in un'atmosfera di 95% O _2/5% di CO ₂ in un apparecchio di coltura bottiglia laminazione a 37 ° C ^15,16. Embrioni di topo in coltura per 16 a 40 ore in queste condizioni definite esposti progressione in sviluppo morfologico delle strutture corporee e diversi embrionali quali il cuore, arti, cervello e occhi indicando adeguati livelli di proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e interazioni tissutali. Analisi molecolare dello sviluppo embrionale nella cultura di uno dei sistemi di organi complessi come l'occhio rivelato lo sviluppo oculare essere coerente con quello osservato nel tessuto oculare in embryos sviluppo in utero (Kalaskar e Lauderdale, in preparazione). Così dimostriamo che gli embrioni di topo coltivate in fase metà della gestazione, mostrano una progressiva crescita e sviluppo morfologico paragonabile a quella osservata negli embrioni di sviluppo in utero.

Protocollo

Cultura embrione di topo:

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con le linee guida del National Institutes of Salute seguente protocollo # A2010 07-119, che è stato esaminato e approvato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso commissione, che mantiene costante supervisione regolamentare.

1. Preparazione of Culture Media

1. Preparare terreno di coltura utilizzando supporti e integratori di cellule staminali disponibili in commercio nei seguenti importi: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplementare (1x), albumina, da siero bovino (2%), penicillina ( 50 UI / ml), streptomicina (50 mg / ml) e Amfotericina B-(1,25 mg / ml). Il mezzo di coltura preparato è simile a quello precedentemente descritto ¹⁵ con le seguenti modifiche: aggiunta di antimicotici e utilizzando due volte la concentrazione di antibiotici (per dettagli di reagenti e attrezzature specifiche, vedere List dei Materiali).
   Nota: la concentrazione di antibiotici usati in precedenza (. Moore-Scott, et al ¹⁵⁾ era sufficiente per le culture embrioni effettuate fino a 24 ore periodo di tempo. Tuttavia, quando la cultura era continuata oltre 24 ore, abbiamo sperimentato la contaminazione della cultura e questo è stato controllato con successo raddoppiando la concentrazione di antibiotico.
2. Conservare i componenti Media a 4 ° C oa -20 ° C secondo le raccomandazioni del produttore. KSR e N-2 Supplemento devono essere conservati in aliquote a -20 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento. KnockOut DMEM una volta aperto deve essere utilizzato entro 30 giorni secondo la raccomandazione del costruttore. Prima dell'uso, riscaldare le parti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
3. Preparare il supporto in condizioni sterili. Disinfettare la superficie di tutte le apparecchiature e le bottiglie contenenti i componenti multimediali con il 70% spruzzo di alcol prima di metterli nel cofano cultura.
4. I componenti media possono essere addizionate sia in un becher sterile o direttamente nel sistema di filtro (Corning). Primo aggiungere la polvere di albumina per il ko DMEM. Mescolare accuratamente scuotendo delicatamente fino a quando l'albumina si scioglie completamente. Quindi aggiungere il N-2 Supplement, KSR e gli antibiotici e mescolare accuratamente con una pipetta. Poi filtrare sterilizzare i media usando un filtro dimensione dei pori 0,22 micron con aspirazione a vuoto. Erogare i media in 50 ml provette coniche e conservare a 4 ° C fino all'uso. I media una volta preparati devono essere utilizzati entro 4-5 giorni per la cultura.

2. Preparazione delle attrezzature Cultura

1. Sterilizzare le bottiglie di coltura di vetro e tappi di gomma. Avvolgere le bottiglie di coltura in un foglio di alluminio e mettere i tappi delle bottiglie di gomma in un bicchiere di acqua e sterilizzare in autoclave.
2. Sterilizzare la camera di coltura (Precision Incubator Unit) con il 70% spruzzo alcol e riscaldare a 37 ° C prima dell'inizio della coltura. La camera di cultura escherzato con un disco di rotolamento al centro che tiene le bottiglie di coltura. Il flusso di gas nella camera è regolata da un manometro e la portata può essere regolata osservando la fuoriuscita di bolle d'aria attraverso l'acqua in un tubo di vetro alla fine. Questo rotolamento apparecchio di coltura bottiglia è una versione modificata dell'apparecchiatura originale introdotte dalla New Cockroft e ^17.
3. Collegare una bombola di gas contenente una miscela di gas di 95% O _2/5% di CO ₂ alla camera di coltura e regolare il flusso di gas a "una bolla d'aria al secondo" che fornisce una portata di 50 cc / min e assicura un adeguato apporto di ossigeno per gli embrioni di cultura.

3. Mouse Embryo Raccolta e preparazione per la Cultura

1. Per ottenere wild type embrioni di topo, abbiamo utilizzato topi di C57BL/6J e CD-1 (Charles River Laboratories) ceppi background genetico.
2. Controllare i topi femmina per tappi vaginali ogni giorno mattina. Il mezzogiorno del giorno di trovare the spina vaginale dovrebbe essere considerato come E0.5 DPC (giorni dopo il coito).
3. Raccogliere embrioni di topo a E10.5 DPC dai eutanasia topi in gravidanza seguenti protocolli standard. I topi sono stati sacrificati mediante un dispositivo di inalazione di CO _2, come specificato dalla American Veterinary Medical Association (AVMA) Linee guida per l'eutanasia degli animali (2013). Per assicurare morte, dislocazione cervicale è stata eseguita dopo esposizione a CO _2.
4. Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale per evitare incollaggio di capelli addominale agli strumenti. Quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando un tagliente-smussato forbici operativi e un paio di 4-3/4 in microdissecting pinze per individuare l'utero. Utilizzando una pinza 4 in microdissecting sollevare l'intero utero e separarlo dal corpo tagliando con una leggera forbici operativi al corpo uterino e alle punte delle corna uterine.
5. Sciacquare rapidamente l'intero utero in 1x PBS riscaldato a 37 ° Cper rimuovere qualsiasi incollaggio sangue verso l'utero e collocare immediatamente in DMEM riscaldato a 37 ° C in una piastra di Petri. Sterilizzare gli strumenti del 70% di etanolo spray prima ulteriore utilizzo.
   Nota: preriscaldamento soluzioni compresa la PBS, DMEM e mezzo di coltura e mantenendole a 37 ° C durante l'intera procedura è consigliata.
6. Sotto un microscopio da dissezione, l'utero deve essere segmentalmente sezionato con una leggera forbice operativi. Ciò si traduce in piccole aperture ai lati dell'utero segmentato attraverso la quale una coppia di modificati (estremità smussate) pinzette microdissecting può essere inserito delicatamente per allargare l'apertura. Ciò permette l'esposizione del decidua placentare, che può poi essere rimosso strappando delicatamente con una pinzetta microdissecting per esporre il sacco vitellino parietale (PYS) con membrana della Reichert. Utilizzando un bordo della pinzetta perforare delicatamente la membrana del Reichert insieme ai PYS e separare da the sottostante viscerale sacco vitellino (VYS) strato per esporre gli embrioni con VYS intatti. Il cono ectoplacental ei derivati ​​trophoectoderm possono essere rimossi sia con la decidua placentare o con membrana di Reichert. Si deve prestare attenzione per evitare la rottura del VYS come gli embrioni pop immediatamente.
7. Gli embrioni con VYS intatti dovrebbero essere trasferiti in una piastra Petri contenente il terreno di coltura riscaldata a 37 ° C con una pipetta di plastica trasferimento.
   Nota: Trasferimento a mezzo di coltura subito dopo la separazione dall'utero aiuta per un migliore sviluppo dell'embrione nella cultura.
8. Una piccola apertura dovrebbe essere effettuato nel sacco vitellino con un paio di pinzette microdissecting evitando principali vasi sanguigni. Un forte pinzetta può essere usato per fare l'apertura forando delicatamente in una zona adiacente alla regione della testa. In alternativa, due paia di pinzette smussate possono essere utilizzati per tenere il sacco vitellino e delicatamente strappare a fare una piccola apertura.Poi allargare leggermente l'apertura espandendo con la pinzetta a una dimensione appena sufficiente per adattarsi alla testa embrionale. La membrana amniotica che è strettamente avvolgendo l'embrione dovrebbe essere tenuto delicatamente via dal corpo e strappata usando un paio di pinzette. La testa embrionale e poi dell'intera embrione dovrebbero essere esteriorizzato delicatamente dal sacco vitellino mantenendo l'integrità del sistema vascolare embrionale con quello del sacco vitellino ^15.
   Nota: Eventuali danni alla vascolarizzazione sacco vitellino potenzialmente in grado di influenzare lo sviluppo dell'embrione in coltura. Tali embrioni con vasi danneggiati non devono essere utilizzati per la coltura e possono essere utilizzati per mettere in scena gli embrioni che può essere successivamente scartati.
9. Criteri di stadiazione embrionali: esaminare gli embrioni sotto il microscopio da dissezione e di gruppo in base a criteri morfologici, tra cui corpo e la dimensione della testa, degli arti e la morfologia degli occhi e stage contando il numero di somite (s) per almeno due embrioni di ogni gruppo.
   Nota: Solitamente embrioni ottenuti dalle stesse differenze lettiera mostra di sviluppo in utero e si differenziano per le dimensioni del corpo, caratteristiche morfologiche e il numero di somiti. Tuttavia, abbiamo scoperto che gli embrioni raggruppati per i nostri criteri morfologici solitamente esposte numero somite simile (± 1). Per questo motivo, non è necessario contare somiti per ogni embrione come questo sarebbe ritardare il tempo per avviare la coltura.
   Nota: non utilizzare gli embrioni che sono stati utilizzati per contare i somiti per la cultura. Contare le somiti dopo aver avviato la coltura per altri embrioni per evitare il ritardo nell'iniziare la cultura. Gli embrioni che sono stati ritardati alla cultura dopo la separazione dall'utero di solito mostrano scarso sviluppo.
10. Trasferire gli embrioni immediatamente ad una piastra di Petri con coltura fresco medio riscaldato a 37 ° C e portarlo alla cappa cultura in cui gli embrioni devono ancora essere trasferiti ad una piastra di Petri sterile con culture supporti prima di metterle in bottiglie di coltura con terreno per iniziare la cultura.
    Nota: I trasferimenti multipli media per gli embrioni prima cultura aiuta a prevenire la contaminazione come le diverse fasi di prelievo e dissezione sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione che non è stato installato nella cappa coltura.
    Nota: Quando la dimensione della cucciolata è di grandi dimensioni (> 12 embrioni), processo la metà degli embrioni e avvia la cultura o metterli in un piatto con terreno di coltura e collocarlo in un incubatore CO ₂ a 37 ° C. Quando gli embrioni sono stati lasciati fuori per periodi più lunghi (> 35-40 min) abbiamo osservato il battito cardiaco a rallentare e questo influenzerà il successivo sviluppo nella cultura.

4. Coltura di embrioni di topo

1. Aprire le bottiglie di coltura in autoclave nel cofano cultura e correttamente li etichetta. Trasferire 3 ml di terreno di coltura riscaldata a 37 ° C per ciascuna di tegli bottiglie e poi gli embrioni di topo devono essere trasferite delicatamente le bottiglie di coltura utilizzando sterili pipette di plastica. Le bottiglie di coltura devono poi essere tappate con i tappi di bottiglia in gomma che aiutano a tenere le bottiglie di coltura per il disco di laminazione nell'apparato cultura.
   Nota: Le bottiglie di coltura con i media possono essere preparati e immessi sul disco rotolamento dell'apparato cultura prima eutanasia topi. Questo riduce il tempo di trasferimento di embrioni in bottiglie di coltura.
   Nota: embrioni di topo possono essere coltivate singolarmente o come co-colture con due o tre embrioni nella stessa bottiglia cultura.
2. Le bottiglie di coltura devono essere effettuate asetticamente all'apparecchio coltura a 37 ° C e strettamente agganciarli ai fori sul disco rotolamento con i tappi di gomma. Accendere il disco laminazione a ruotare ad una velocità costante di 35 giri al minuto (rpm), che consente il libero galleggiamento del embryos nei media e aiuta anche in cambio gas libero dal tessuto embrionale. Il gas dal cilindro collegato alla camera di coltura fluisce attraverso il disco di rotolamento e tappi di gomma nelle bottiglie di coltura.
3. Cultura gli embrioni per 16-40 ore e controllare regolarmente per il deflusso dei gas e la temperatura camera di coltura.
   Nota: la manipolazione degli embrioni Mouse in cultura: Lasciate che gli embrioni vengono adattate alle condizioni di coltura per almeno 30 min. Poi embrioni che eseguono male e mostra il battito cardiaco debole possono essere scartati e le restanti embrioni possono essere utilizzati per ulteriori studi di manipolazione. Manipolazioni Embrione come l'elettroporazione ^5,9,16, microiniezioni ^18, perlina impianto ^16, il trattamento farmacologico e le altre procedure possono essere eseguite in questo momento. Abbiamo eseguito con successo l'impianto di affi-gel agarosio perle trattati con determinate molecole di segnalazione per studiare il loro ruolo nello sviluppo dell'occhio presto. Gli embrioni dopomanipolazioni possono essere restituiti indietro in un mezzo fresco e proseguite nella cultura.
4. Sostituire i terreni di coltura totalmente con mezzi freschi a intervalli specifici dopo 9-10 ore e 18-19 ore di cultura in cui la cultura è stata continuata per 40 ore.
   Nota: Culture sostituzione supporto non può essere richiesta se la cultura viene fermato da 16-18 ore.
5. Misure di successo nella cultura: la sopravvivenza embrionali in coltura deve essere determinato dal battito cardiaco visibile e la circolazione del sangue nel corpo durante la crescita embrionale nella cultura dovrebbe essere valutata da aumento di dimensioni del corpo, il numero somite e sviluppo morfologico della testa, degli arti, cuore e gli occhi.
6. In utero sviluppato embrioni a E11.0 DPC (~ 40-41 s) e E12.0 DPC (~ 49-50 s) dovrebbe essere utilizzato come controllo per il confronto embrioni coltivati ​​per 16-18 ore e 38-40 ore, rispettivamente.
7. Lo sviluppo embrionale in diversi momenti durante la cultura e per a tappe utero può essere Captrato sotto dissezione microscopio. Software di imaging spot è stato utilizzato per catturare le immagini e successivamente elaborati utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

Risultati

Sviluppo di embrioni di topo ex utero dipende da molteplici fattori a partire dal momento in cui l'utero è isolato dal corpo al tempo gli embrioni sono coltivate. Come illustrato nella Figura 1, la procedura prevede una serie di operazioni, in particolare, la separazione di utero gravido dal corpo (Figura 1A), l'isolamento degli embrioni con intatta sacco vitellino (Figura 1B), esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino ( Figura 1C)

Discussione

Embrioni metà della gestazione topo fase sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero in un'atmosfera di 95% O _2/5% di CO ₂ in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Sviluppo embrionale ex utero è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento in cui il utero è isolato dai topi sacrificati al completamento della coltura (Figura 1). Il fattore più importante che influenza lo sviluppo è ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S