La coloscopie flexible chez la souris pour évaluer la sévérité de la colite et de tumeurs colorectales l'aide d'un système validé endoscopique de notation

Résumé

Au cours des dernières années, de nouveaux endoscopes génération ont émergé comme aides à la recherche de diagnostic importants pour évaluer la colite murine et les tumeurs colorectales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'évaluation endoscopique de tumeurs colorectales et inflammation chez des souris, ainsi que d'un système de pointage roman qui utilise des identificateurs décimaux pour documenter la sévérité de la colite endoscopique et tumeurs colorectales.

Résumé

L'utilisation de l'endoscopie moderne à des fins de recherche a grandement facilité notre compréhension des pathologies gastro-intestinales. En particulier, l'endoscopie expérimental a été très utile pour des études qui nécessitent des évaluations répétées sur un seul animal de laboratoire, tels que ceux évaluer les mécanismes de la maladie intestinale inflammatoire chronique et la progression du cancer colorectal. Cependant, les méthodes utilisées dans les études sont très variables. Au moins trois systèmes de notation endoscopiques ont été publiées pour la colite murine et publié protocoles pour l'évaluation des tumeurs colorectales ne parviennent pas à répondre à la présence d'une inflammation du côlon concomitante. Cette étude développe et valide un système de notation endoscopique reproductible qui intègre en même temps une évaluation de l'inflammation et des tumeurs. Ce nouveau système de notation comporte trois grands volets: 1) l'évaluation de l'étendue et de la gravité de l'inflammation du côlon (basé sur les résultats périanales, la transparence de l'wall, des saignements des muqueuses et des lésions focales), 2) l'enregistrement quantitative des lésions tumorales (de la carte de la grille et graphique à barres), et 3) tri numérique de cas cliniques par leur pertinence pathologique et de la recherche en fonction des unités décimales avec les catégories affectées de lésions observées et complications endoscopiques (identifiants décimales). La vidéo et le manuscrit présenté ici ont été préparés suivant des protocoles IACUC approuvés, pour permettre aux enquêteurs de marquer leurs propres souris expérimentales en utilisant une méthode endoscopique bien validé et hautement reproductible, avec l'option de système de différencier distale de la colite endoscopique proximale (D-PECS ).

Introduction

Endoscopie murin a été réalisée comme un outil de recherche utile pour plus d'une décennie ^1-3. À ce jour, la plupart des études utilisant l'endoscopie murin ont utilisé les endoscopes rigides, même si certains ont également utilisé la sigmoïdoscopie flexible. Endoscopie murin fournit des résultats immédiats et une estimation plus objective de la mesure de la normalité intestinale, la sévérité de l'inflammation, et la progression de la tumeur par rapport à des mesures indirectes, comme la perte de poids, diarrhée, et l'histologie (qui n'est pas optimale lorsque les lésions sont inégaux), tandis que offrant un aperçu sur l'état de santé général du côlon. Plus particulièrement, l'endoscopie permet d'évaluer répétée de modèles d'animaux de laboratoire au fil du temps, par opposition à l'examen histologique traditionnelle qui exige que l'animal soit euthanasié et colons à être récoltées pour l'analyse ^1. Malgré ces avantages, l'utilisation de la technologie endoscopique murin n'a pas été répandu et est limitée par le manque de protocoles normalisés pour implementatisur et la notation des résultats pathologiques. Correctement mis en œuvre, l'endoscopie murin est très prometteuse pour faciliter notre compréhension et la caractérisation de modèles animaux de plusieurs états de maladies gastro-intestinales chroniques, notamment les maladies inflammatoires de l'intestin, colite, et les tumeurs colorectales.

L'utilité de la technologie endoscopique murin repose sur sa reproductibilité et l'objectivité, ce qui nécessite l'existence de procédures d'examen normalisés et un système de notation cohérente, non redondante et fiable pour les pathologies intestinales. Au moins trois systèmes de notation pour l'évaluation endoscopique descriptives de la colite ^4-6, ainsi que pour les tumeurs du colon chez les souris ^4,7,8 ont été publiées. Cependant, ces approches déclarés et les systèmes de notation ne sont pas facilement comparables entre les études. Dans de nombreux cas, il n'existe pas de définition claire des critères utilisés pour la classification des lésions, et lorsque les critères sont donnés, ils sont très variables. De plus,il n'existe aucun système de notation signalés qui intègrent l'évaluation à la fois la colite et les tumeurs, deux pathologies coliques les plus courants qui peuvent se produire simultanément et avoir des effets interactifs sur le résultat, dans un outil de mesure unique. Enfin, les systèmes de notation endoscopiques qui n'existent pour la colite ont souvent catégories inflammatoires de la discrimination limitée (c.-à-. D'options étroites de notation sur des échelles entières courtes, souvent 1-4) pour représenter correctement la maladie scénarios de progression et permettre l'utilisation de l'analyse statistique paramétrique.

Dans ce document, nous décrivons l'utilisation d'un endoscope flexible pour évaluer la sévérité de la colite murine et les tumeurs du côlon et de décrire un protocole standardisé pour l'emploi de cette technologie dans l'évaluation anatomique de la région péri-anale, du rectum et du côlon distal. Nous illustrons dépannage efficace pendant l'endoscopie pour minimiser les traumatismes et les artefacts d'image, et nous décrivons un système de notation reproductiblebasée sur des paramètres cliniques publiées validés. Le système de notation intègre l'évaluation de l'inflammation intestinale et les tumeurs en utilisant un niveau élevé de discrimination avec 12 niveaux possibles de la cartographie de l'inflammation, tumeur et des options de tracé, et un nouveau système de l'unité décimale (c'est à dire, les identificateurs décimaux) pour mettre en évidence les résultats avec une valeur diagnostique spécifique ( le développement de tumeurs à savoir, les complications au cours de l'endoscopie, etc.) L'utilisation d'identificateurs décimaux permet un suivi rapide des ensembles de données pertinents pour une analyse ultérieure en aval. Enfin, nous effectuons essais de fiabilité et de validité du système de notation dans plusieurs modèles murins de colite et cancer de la colite associée (sulfate de dextran sodium (DSS) induite par la colite, infection à Clostridium difficile, et azoxyméthane / induite par DSS-cancer du côlon).

Protocole

Une. Mise en place du système d'endoscopie

1. Mettre en place le système d'endoscopie avant d'anesthésier les souris, en suivant les instructions du fabricant. Utilisez une urétéroscope vidéo conçu pour les humains de ce protocole (Figure 1). Le diamètre externe du tube d'insertion est de 9,9 Fr (3,3 mm), son extrémité distale est de 8,5 Fr (2,8 mm), et le diamètre intérieur du canal d'instrumentation est 6 Fr (1,2 mm).
2. Bien que l'utilisation d'endoscopes n'ont pas été liée à la transmission de la maladie [9], stériliser l'endoscope et de la lentille avec 70% d'éthanol ou ¹⁰ par des techniques appropriées lorsque l'on travaille avec des micro-organismes formant des spores. Préparer lubrifiant bactériostatique et non-grattage essuyer tissus pour saturer le bout de l'endoscope.
3. Attacher une seringue de 3 ml remplie d'air (ou d'un mélange de gaz approprié de CO ₂₎ à la partie supérieure du canal d'instrumentation.
4. Tournez sur la puissance, et mettre en place la balance des blancs dans la lumière blanche normale,ainsi que le mode étroit imagerie de bande (NBI), le cas échéant. Depuis 2001, le PNB a procuré des avantages de l'imagerie diagnostique comme il met l'accent sur ​​les structures fines des vaisseaux sanguins sur les muqueuses, y compris les lésions ulcéreuses et tumorales, qui ont une vascularisation anormale caractéristique ^11. Mode NBI-filtre limite la longueur d'onde de la lumière capturée à 390-445 nm et 530-550 nm, qui met en évidence les structures avec l'hémoglobine.
5. Imprimer le formulaire d'évaluation de notation (figure 2) pour enregistrer vos résultats. Se familiariser avec les images normales et attendues de l'IBN (figure 3A) et la définition et les qualités de chaque critère avant l'examen (voir la section 6.1).
6. Préparer une solution à base de colorant sur le tampon phosphate salin (PBS) pour chromoendo, si on le souhaite. En chromoendoscopie, l'examen est effectué en utilisant un colorant comme agent de contraste pour mettre en évidence les modifications de la muqueuse. Utilisez le bleu de méthylène (0,1-1%) et de l'indigo carmin (0,1%) solutions (figure 3B). Remarqueque le bleu de méthylène est un agent d'oxydo-réduction qui peut produire des radicaux oxydants, la reticulation indirect de résidus d'acides aminés, et la dégradation de l'ADN ^12, ce qui pourrait interférer avec l'analyse de l'échantillon.

2. Anesthésie générale de la souris

1. Choisissez l'agent et la voie d'administration anesthésique. Consulter un vétérinaire à partir d'un centre de ressources animales de soins et d'utilisation des animaux institutionnel Comité (IACUC) concernant les interférences potentielles des médicaments avec le système immunitaire et les objectifs de recherche. Certains médicaments peuvent influencer le profil de l'expression des cytokines chez les animaux, y compris les rongeurs ^13. Utilisez tribromoéthanol injectable pour les procédures de terminal ou l'isoflurane pour les endoscopies de survie, avec des contrôles appropriés.
2. Pour l'induction, administrer 4-5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un taux de 0,2-0,5 L / min; utiliser 0,5-2% pour l'entretien. Ce protocole n'est pas approprié pour tous les animaux. Consultez votre établissement vétérinairepour les instructions et la formation nécessaires. Respecter les recommandations pertinentes du IACUC pour atteindre les plus hautes normes de bien-être animal. Assurez-vous que la souris si totalement anesthésiée.
3. «Strap» La souris anesthésiée à une table de surface de support dans une dorsale ou ventrale en utilisant du ruban adhésif de laboratoire. Méfiez-vous de l'orientation anatomique sur l'écran de votre endoscope. Fixer ses membres inférieurs et la queue. Une bande de bande peut également être placé sur la poitrine pour empêcher le mouvement loin de l'appareil respiratoire, mais éviter de restreindre les mouvements ventilatoires thoraciques.

3. Examen détaillé endoscopique

1. Rechercher des lésions péri-anales avant d'insérer l'endoscope dans le rectum, puis avancez le champ par l'anus.
2. Manteau de l'endoscope avec un lubrifiant chirurgical stérile. Veillez à ne pas recouvrir la surface de la CCD (dispositif à couplage de charge) capteur.
3. Insérez l'endoscope et commencer l'enregistrement. Les vidéos enregistrées sont utiles pour mévaluation eticulous de l'endoscopie si nécessaire après l'examen. Essayez d'effectuer la endoscopie dans la longueur moins de temps possible pour minimiser l'irritation intestinale / muqueuse.
4. Appliquer de l'air à l'aide d'une seringue à mettre lentement en dehors de la paroi intestinale. Selon la taille de la souris, en utilisant 1 à 2 ml d'air. Évitez excessive insufflation d'air, il peut causer de la détresse respiratoire et la mort de la souris anesthésiée.
5. Faire progresser l'endoscope avant que vous ne videz pas la façon avec de l'air ou une légère rotation de la portée. Ne pas avancer l'endoscope si vous ne voyez pas la lumière intestinale. Perforations ou rectales / côlon larmes peuvent se produire à ce stade, en particulier chez les jeunes souris (<8-10 semaines). Prenez des photos si nécessaire.
6. Comme la portée avance, évaluer s'il ya saignements spontanés (définie comme l'état naturel des muqueuses hémorragie pas associée à l'endoscopie traumatique). Saignements spontanés peut être observé comme l'endoscope entre le rectum et le côlon.
7. CommeSess la transparence de la paroi colique. La transparence est définie comme étant la capacité de visualiser les vaisseaux sanguins intra-muros dans le colon et que d'autres viscères environnants (figure 4). Mouvement doux de la portée (arrière-avant, droite, à gauche) vous aidera à déterminer si les vaisseaux sanguins peuvent être vus dans le contexte d'autres viscères. Tissu adipeux mésentérique peut également être considérée. Notez que si le rectum à l'intérieur de la cavité pelvienne apparaît moins transparente que la paroi du côlon dans la cavité abdominale.
8. Inspecter pour déterminer le type et le nombre de lésions focales (zones oedémateux, des érosions, des ulcères, des masses tumorales). Ce sera enregistrée sous forme de notation à l'aide du score d'inflammation du côlon et les identificateurs décimaux qui ont été développés.
9. Une fois la zone où le colon fléchit caudale dans le côlon proximal est atteinte, retirer l'endoscope lentement et rechercher la présence de saignements de contact (qui se produit en raison de la friabilité des muqueuses après laendoscope est avancé ou retiré). Il n'est pas nécessaire de gratter la surface du colon intentionnellement. Muqueuse colorectale saine ne saigne pas après examen endoscopique approprié.

4. Biopsie

1. Lorsque biopsies sont nécessaires, insérer la pince à biopsie à travers le canal de l'endoscope dédiée pour l'instrumentation. Surveillance de l'avancement de la pince sur l'écran de l'endoscope pour éviter une perforation intestinale.
2. Ouvrez les coupes de biopsie de la pince à environ un angle de 60-80 ° tasse à café, et les diriger vers la zone d'intérêt. Une pince ou d'une pression excessive ouverts peuvent comprendre des couches supplémentaires de tissu intestinal, ce qui se traduit par une perforation induite par biopsie des parois intestinales transparentes sains. Si la perforation se produit, euthanasier l'animal pendant l'anesthésie suivant vos recommandations IACUC. Les perforations se traduisent par une endotoxémie et d'une péritonite.
3. Fermez les coupes de biopsie, et de les sortir tout en gardant les pinces fermées.
4. Remove de l'échantillon à partir de la pince en rinçant le tissu avec une solution qui est doux pour le tissu et la pince. ARN tard et PBS sont des solutions de travail communes, si nécessaire, utiliser l'aiguille pour déloger l'échantillon. Éviter d'éroder les tasses de pince ou arêtes de coupe.

5. Récupération de l'anesthésie

1. À l'issue de l'examen, un environnement chaud à la souris jusqu'à ce qu'il récupère. Utilisez soit une lampe électrique, ou un tampon chaud réglé à 37 ° C. Éviter la surchauffe; vasodilatation périphérique compromet récupération d'animaux. Surveillance de la souris près jusqu'à guérison complète.

6. Scoring System endoscopique intégré de santé colorectal avec décimales identificateurs

1. Utilisez le formulaire de notation (figure 2) et les définitions de paramètres ci-dessous (évaluation endoscopique de murins colorectal inflammation et les tumeurs en utilisant un système décimal pondéré de notation: Définitions des paramètres, et le Protocole) pourexemples et la «distal-proximal endoscopique colite système de notation» en option (D-PECS) que des lignes directrices pour l'évaluation non biaisée et la tenue de registres détaillés.
2. Note les quatre paramètres de l'inflammation colorectal décrits sur le formulaire de système de notation (figure 2). Évaluer soigneusement la région péri-anale, la transparence intestinale, le type de saignement intestinal (le cas échéant), et la présence et la quantité de lésions focales (érosive, hémorragique et / ou tumorale).
3. Lors de l'évaluation des tumeurs à des fins de recherche, d'examiner la quantité, l'emplacement et la taille, et les décrire à l'aide de la carte du côlon et graphique à barres sur le formulaire de notation. La somme numérique des scores obtenus et le nombre de lésions (le cas échéant) afin de déterminer l'arrière-plan inflammation du côlon, du type de lésion le plus prédominant, et le nombre de lésions.

Résultats

Le protocole et les images présentées dans cette étude ont été préparés avec un endoscope souple Olympus URF-V ¹⁴ et PNB ^11,15. Les images vidéo ont été enregistrés dans le format MPEG-2 et des images au format JPG, TIF, PNG, ou format DICOM avec un maximum de 1280 x 1024 pixels, transférables à des mémoires portables USB flash standard. Le PNB augmente le contraste visuel des tissus contenant de l'hémoglobine. Lumière normale et imagerie PNB sont des éléments clés pour illus...

Discussion

Il ya plusieurs considérations concernant la modification et la réparation de la technique endoscopique chez la souris. Aspects critiques de la procédure qui doivent être maîtrisées lors de l'utilisation de l'endoscopie souple comprennent l'ajustement du volume d'air nécessaire pour éviter une distension abdominale et de troubles respiratoires de la souris, et les aspects techniques mineures de vue contrôle de la coordination des contrôles d'angulation et de couple . Le contrôle de couple ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System