Fare Modelinde utero-tubal Embriyo Transferi ve Vazektomi

Özet

Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.

Özet

Bir taşıyıcı dişi preimplantasyon embriyo transferi epigenetik değişiklikler etkisi takip eden fetal gelişim ve yetişkin sağlığına preimplantasyon gelişimi sırasında kökenli incelemek için genetik olarak modifiye edilmiş fare veya üretimi için gerekli bir adımdır. Etkin ve tutarlı bir embriyo transfer tekniğin kullanılması, genetik olarak tadil edilmiş hayvanların üretimi artırmak ve emplantasyon oranlarının ve dönemde hayatta kalma farklı tedavilerin etkisini tespit etmek önemlidir. Blastokist aşamasında embriyolar genellikle embriyo manipülasyon pipet tanıtmak için rahim duvarında bir delinme performans, rahim transferi ile aktarılır. Pipet geri çekilmesinden sonra, rahim içinde gerçekleştirilen menfez kapatmaz ve bağlı rahim pozitif basınca karın boşluğuna embriyolar çıkış olabilir. Delinme de, implantasyon kanaması bozar üretmek blok transferi pipet ve embriyo d etkileyebilir olabilirzona olmayan embriyolar aktarılır özellikle evelopment. Sonuç olarak, bu teknik genellikle çok değişken ve genel düşük embriyo sağkalım oranları ile sonuçlanır. Bu olumsuz etkileri önledikleri, utero-tubal embriyo transferi, embriyo çıkışı engelleyen doğal bir engel olarak utero-tubal kavşak yararlanmak ve rahim duvarının delinmesi kaçının. Vasektomize erkek yalancı alıcıları elde etmek için gereklidir. Vazektomi gerçekleştirmek için bir teknik utero-tubal embriyo transferi bir tamamlayıcısı olarak tarif edilir.

Giriş

Embriyo transferi muhtemelen fare modelinde yapılan en sık cerrahi prosedürdür. Bu teknik, in vitro manipülasyon tekniklerine tabi embriyolardan yavrular elde etmek için gerekli olan ve bu nedenle, pro-nükleer enjeksiyon, transdüksiyon lentiviral ya da kimera formasyonu ile genetik olarak modifiye edilmiş modellerin geliştirilmesi için gerekli bir adım teşkil etmektedir. Bunun yanı sıra, teknik preimplantasyon gelişimi sırasında meydana gelen akıntılar çeşitli gelişimsel etkileri çalışma sağlar. Yapay üreme teknikleri ¹ ya da farklı maddelerin veya metabolitlerinin ² anormal konsantrasyonlara maruz kalma kullanılması implantasyon veya plasenta başarısızlıkları ve yavrular uzun vadeli etkileri sonucu embriyo gelişimini etkileyebilir. A, güvenilir ve tekrarlanabilir bir embriyo transfer tekniği tutarlı bir insanda emplantasyon ve fetus gelişimi üzerindeki deneysel tedavinin olası olumsuz etkilerini test etmek için çok önemlidirner.

Mürin preimplantasyon embriyolar 0.5 gün sonrası coitum ve ampülleri (DPC) psödopregnant alıcıları (yumurtalığa transferi) ^3,4 veya 2,5 DPC psödopregnant alıcının rahim içine (rahim transferi) ^5,6 vasıtasıyla yumurta kanalına ya alıcı bir dişiye transfer edilebilir onların gelişim evresine bağlı. Embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerin enjeksiyonu ile kimerik farelerin üretilmesi için kullanılanlar gibi blastosit aşamasında Embriyolar, genellikle rahim transferi ile aktarılır. Blastosistler, aynı zamanda bir 0,5 DPC alıcının tuba kanalından aktarılabilir, ancak embriyo implantasyonu gerçekleşmeden önce boşaltım kurtarmak için 2 gün diapause uğrar ve sahip olduğu için, gelişim bozucular için daha az fizyolojik testi oluşturmaktadır. Uterus Transfer rahim lümenine bir embriyo manipülasyon pipet erişim sağlayan bir açıklık oluşturmak için dar bir iğne ile delinmesi rahim duvarına içerir. Although bu tekniği iyi sonuçlar verebilir vadede hayatta kalma (yani bir yavru geliştirmek transfer edilen embriyo yüzdesi) genellikle düşük ve ^7,8 önceden kestirilemez.

Rahim duvarının delici bazı zararlı yan etkileri gerektirir. İlk olarak, oldukça yüksek oranda damarlanmış bir miyometriyum dokusu ve delinme genellikle küçük bir kanama ile sonuçlanır. Kan embriyo transfer pipet engellemek ya da embriyonik ölüm ve / veya implantasyon başarısızlığı neden uterus lümen istila edebilir. Kan hücreler ve döküntüler, blastomerlerin eklemek gibi zona olmayan embriyolar, aktarılır, bu özellikle önemlidir. Embriyoların aktarıldıktan sonra, İkinci olarak, gerçekleştirilen açılış mühür etmez, bu nedenle de menfezi içinden geri akabildiği için ve bir çok büyük hacimli rahim içine tanıtmak edildiğinde karın boşluğuna ihraç edilebilir. Açıklanan utero-tubal embriyo transfer Burada embr teslim utero-tubal kavşak yararlanmakrahim duvarına delinmesi ve böylece olumsuz etkileri ⁹ önleme gerek kalmadan rahim içine yolar.

Embriyo transferi için kullanılan yalancı Alıcı dişiler erkeklerin vasektomize ^8, doğal çiftleşme ile elde edilir. Steril erkek tarafından üretilen seminal salgıları embriyo transferi için açık olmak için rahim için gereklidir. Bir alıcı almak için, 6 aylıktan 8 hafta 2 kadın maksimum öğleden sonra bir vazektomize erkek ile yerleştirilir. Sonraki sabah, kadınlarda vajinal birleşme fiş, erkek seminal sıvıdan pıhtılaşmış protein bir yığın varlığı için kontrol edilir. Çiftleşme genellikle gece yarısı sırasında ortaya olarak, vajinal fiş algılama gün DPC 0.5 olarak kabul edilir. Vasektomize erkek bir satıcılardan satın alınabilir, ancak burada tarif edilen bir cerrahi prosedür nispeten kolaydır ve embriyo transferi için gerekli olan başka ilave bir araçları gerektirmez.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri USDA Hayvan Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca Beltsville'daki Bölgesi Hayvan Bakım ve Kullanım Comittees (BAACUC 11-015) tarafından onaylanmıştır.

1.. Anestezi ve Analjezi (Cerrahi Prosedürleri İkisi için ortak)

1. Fare tartılır ve 27 G iğne ile iki 1 ml şırınga aşağıdaki anestezik ve analjezik yük:
   1. Ketamin (0.1 mg / g: 0.01 ml / a 10 mg / ml çözelti g) ve ksilazin (0.01 mg / g: 2 mg / ml çözeltisi 0.005 ml / g).
   2. Buprenorfin (0.1 ug / g: bir 0.01 mg / ml çözeltisi 0.01 mi) eklenmiştir.
2. Başparmak ve işaret parmakları ile mümkün olduğunca çenelerine kadar yakın da boyun ense toplayıp, küçük ve yüzük parmakları arasında kuyruk tutarak fare hareketsiz.
3. Intraperitoneal ketamin-Xylazine karışımı enjekte edilir. Iç organları delinmesiyle önlemek için, fareyi tutunhafifçe kalça seviyesinin altındaki merkez (Şekil 1A)
4. Başparmak ve işaret parmakları (Şekil 1B) arasındaki boyun beklemeye ense Buprenorphine subkutan enjekte edilir.
5. Sıcak bir sahnede kafes (temiz ve başka bir hayvan olmadan) fareyi bırakın.
6. Bilinçsiz bir kez, (ayak tutam tarafından kontrol) arka ayak refleksinin olmaması için kontrol edin. Göz kuruluğu önlemek için ve palpebral refleks (Şekil 1C) yokluğunda kontrol etmek için göz merhemi sürün.
7. Bu protokol, aşağıda tarif edilen prosedürleri gerçekleştirmek için yeterli, 30 dakika içinde en az bir cerrahi anestezi düzlemi içerir (Protokoller 2 ve 3). Daha uzun süreler gerekirse, 1.1.1 'de tarif edilen dozajın yarısı ketamin + ksilazin enjeksiyonu ek 30 dakika sonra uygulanabilir. Daha hızlı ve düzensiz bir desen için, solunum bir değişiklik gösterir loUygun anestezi düzleminin ss.

2. Meni kanalı ameliyatı

1. Kanıtlanmış bir çiftleşme performans ile bir erkek kullanın.
2. , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin.
3. Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin.
4. Kaldırmak, sıcak bir sahnede fare yerleştirin iki hayali enine çizgi arasındaki ventral alanından elektrik kesme makineleri ile kürk 0.5 cm ve penis üzerinde 2.5 cm (Şekil 2A) yerleştirildi.
5. % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize.
6. Traş bölgesini açıkta bir delik steril bir havlu ile cerrah ve kapağına doğru kuyruğu ile yatar pozisyonda fare yerleştirin. Cerrahi alanını aydınlatır.
7. 10-15 mm boyuna cilt incisio gerçekleştirinn, yaklaşık 1 cm penis üzerinde karın, medial tutulmaktadır. Dişli forseps pansuman ve sonra, (Şekil 2A ve 2B) makasla kesme ile cilt tutun.
8. Linea alba, 5-10 mm boyuna kesi yapmak. Tırtıklı forseps Microdissecting ile kas tutun ve makas (Şekil 2C) ile kesti.
9. Tırtıklı diseksiyon forseps ile mikro bir tarafta testis yağ pedi kapmak ve testis maruz çekin, vaz deferens ve epididimis. Vas deferens testis medial bulunan ve bu gibi testis duvara bağlı değil açıkça ayırt ücretsiz tüp (bir Bir kan damarı, bir tarafta (Şekil 2D) birlikte çalışan epididimis).
10. Onlar kırmızı açmak kadar mikro diseksiyon tırtıklı forseps, alev soyunma forseps ile vas deferens Holding (Şekil 2E Rong, ve sonra (Şekil 2F) aynı anda iki noktada vaz deferens kesmek ve dağlamak için bunları kullanın. Kesilen yaklaşık 5 mm bir bölümünün ayrılması ve iki net bir şekilde ayrı dağlanmış uçları (Şekil 2G) geride bırakmak gerekir.
11. Geri karın boşluğuna testis, epididim ve vas deferens taşıyın.
12. Diğer testis adım 9 geçin.
13. 5/0 emilebilir sütür (Şekil 2H) ile yapılan bir ya da iki yatay yatak dikiş ile kas dikin.
14. Bir ya da iki yara kesme makineleri (Şekil 2I) ile cildi dikin.
15. , Vasectomised erkek (kulak yüzük, parmak dövme ...) tanımak bir sıcak sahnede yerleştirilen kafes taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak). Sıcak bir tuzlu su çözeltisinden 0.5-1 ml deri altı enjeksiyon yeniden artırırPasa. , Vazektomi aktarımı sırasında meydana gelen olası olaylar kaydedin içme suyuna antibiyotik ekleyin.
16. Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da diş forseps bir çift ile vazektomi sonrası kaldırılabilir. Vazektomize erkek ameliyattan 2 hafta sonra çiftleşmeye hazır olacaktır.
17. Alıcıları elde etmek için kullanmadan önce bereketli dişilerle çiftleşme tarafından vazektomize erkek infertilite sınayın.

3. Utero-tubal Embriyo Transferi

1. Fare morulları veya blastosistleri 2.5 DPC bir yalancı alıcı kadın için bu teknikle transfer edilebilir.
2. Embriyo manipülasyon cam pipet hazırlayın:
   1. Pipet tutucu zarar görmesini önlemek amacıyla cam kılcal damarların ipuçlarını parlatın.
   2. Hafifçe dönerken iyi bir alev ile ısıtılarak cam kılcal bir orta parça yumuşatıreşzamanlı iki elinizle kılcal. Kılcal bölüm yumuşak ve (açık kırmızı renkli) dövülebilir olduktan sonra, alevden hızla çekilme ve 130-150 um dış çapını daraltmak için iki ucunu çekin.
   3. Cam soğuması ve sonra hafifçe bir elmas nokta kalem, aşındırıcı taş veya tırnak törpüsü ile dar kısmını puanlama ve her iki taraftan çekerek onu kesmek için bekleyin. Mola temiz ve dik olmalıdır
3. Bir 100-130 mikron diyafram bırakarak, çok hızlı yanan tarafından ucu parlatın. Pipetler daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
4. Sıcak embriyo manipülasyon medya (CZBH veya M2, tartışmaya bakınız).
5. , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin.
6. Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin.
7. T tutulmasıO sıcak bir sahnede fare, diz ve distal kaburga (Şekil 3A ve 3B) arasındaki sırt bölgesinde elektrik kesme makineleri ile kürk çıkarın.
8. % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize.
9. Prewarmed embriyo manipülasyon medya inkübatör embriyolar taşıyın.
10. Stereomicroscope altında sıcak bir aşamaya alıcıyı taşımak ve (başını sağa veya cerrahın sol tarafına bakan) cerraha yanal yüzükoyun pozisyonda yerleştirin.
11. Traş bölgesini açıkta bir deliği olan bir steril havluyla alanı kapsayacak ve cerrahi alanını aydınlatır.
12. Son kaburga ile kalça ve arka ve karın (Şekiller 3A, arasındaki hattın dorsal ⅓ arasındaki hattın kafatası ⅓ üzerinde bulunan bir nokta deride bir 1 cm enine (dikey) bir kesi yapınnd 3B). Tırtıklı forseps pansuman ile cildi tutun ve makas (Şekil 3C) ile kesti.
13. Cilt kesilmiş sonra, yumurtalık (kırmızı / turuncu) veya yumurtalık (beyaz) çevreleyen adipoz ped gövde duvarından görselleştirilebilir. Kesi herhangi bir büyük kan damarı kesmez bir nokta olarak yumurtalık ya da yağ pedi üzerinden gövde duvarında bir 0.3-0.5 cm enine (dikey) bir kesik yapın. Mikro diseksiyon dişli forseps ile kas tutun ve makas (Şekil 3D) ile kesti.
14. Onun baş cerrah doğru bakan olması için fareyi hareket ettirin.
15. Embriyo manipülasyon pipet (Şekil 3E) yükleyin:
    1. CZBH ortam daha geniş olan kısmı yaklaşık olarak 5 mm kadar manipülasyon pipet dar kısmı boyunca kapilarite ile yükselmeye izin verir.
    2. Küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) kadar sürebilir.
    3. Embriyolar (5-10) tanıtmakmedya az miktarda (2-4 mm).
    4. Başka küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) ve medya küçük bir miktar (0.5-1 mm) kadar sürebilir.
    5. Ağız aspiratör tutucu ya da adım 3.17 hazır elle çalıştırılan cihaza takılı cam pipet bırakın.
16. Mikro diseksiyon dişli forseps ile yumurtalık çevreleyen yağ pedi tut ve yumurtalık, yumurta kanalının, ve karın boşluğundan dışarı üst rahim küçük bir bölümünü (Şekil 3F ve 3G) maruz fare kafasına doğru çekin.
17. Yumurta kanalının taşımak ve (yumurtalığa rahim karşılayan yani) utero-tubal kavşak maruz mikro diseksiyon tırtıklı forseps ile yağ pedi kapmak, kullanıma hazır, ağızda aspiratör ağız parçasını tutan.
18. Erişilebilir utero-tubal kavşak tutulması, (sağ elini ise) sol elinizle hafif kavisli mikro diseksiyon forseps almak ve hemen altına yerleştirmeko kısmı Yukarıda 2 mm hakkında yumurta kanalının kapma utero-tubal kavşak.
19. Hafif kavisli mikro diseksiyon forseps ile utero-tubal kavşak Holding, 27 G iğne (Şekil 3H) ile forseps yakın yumurtalığa bölümü delinme.
20. Utero-tubal kavşağı ile rahim iğne ve peşin ile yapılan deliğine embriyo manipülasyon pipet takın (3I ve 3J Şekiller). Pipet utero-tubal kavşak (Şekil 3K) geçtikten sonra kolayca kayar. Enkaz endometrial hasarı (en fazla 3 mm) ve pipet engelleme önlemek için rahim içine çok uzak ilerleme yok.
21. Yavaşça (Şekil 3L) üfleme ile rahim içine embriyo bırakın. Hem hava kabarcıkları rahim geçmelidir. İlk baloncuk yukarıdaki ortamın BazıAyrıca rahim içine salınan, ancak implantasyonu engelleyebilir gibi, daha fazla hava tanıtan önlemek olabilir.
22. Embriyolar rahim içine serbest bırakıldı hemen sonra pipet çıkarın.
23. Yumurta kanalının Taşı ve adipoz ped kapma geri karın boşluğuna yumurtalık.
24. 5/0 emilebilir sütür (Şekil 3M) ile yatay bir yatak dikiş ile kas dikin.
25. Bir yara makası (Şekil 3N) ile cildi dikin.
26. Gerekirse diğer tarafta aşama 10 devam edin.
27. , Alıcı (kulak halkası, parmak dövme ...) tanımlamak (sıcak sahnede yerleştirilen) kafesine taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak).
28. Embriyo transferi sırasında meydana gelen olası olaylar açıklama ve içme suyuna antibiyotik ekleyin. Sıcak SalI bir 0.5-1 ml deri altı enjeksiyonne çözelti kurtarma geliştirir.
29. Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da forseps (Şekil 3O) iki çift embriyo transferi sonrası kaldırılabilir. Alıcı gebelik değerlendirmek ve yavruların sayısını tahmin etmek için o gün tartılır olabilir. 15 gün embriyo transferinden sonra alıcıya yavru malzeme sağlar.

Sonuçlar

Utero-tubal embriyo transferi rahim embriyo transferi ^2,9,10 ilişkili komplikasyonlar bazı kaçınarak rahim embriyo transferi için bir olanak sağlar. Tablo 1 'de, biz tarif edilen protokol takip CD1 alıcıya manipülasyonlar farklı tabi CD1 blastosist transfer edilen bazı temsili bir sonuç göstermektedir. Dönem (bir yavru elde embriyoların%) ya da (lentivirüs maruz durumunda) E15 hayatta kalma hayatta kalma zigot aşama (IVC) in vitro olarak kültürlenmiş embriyola...

Tartışmalar

Vazektomi büyük zorluklar içermeyen nispeten düz ileri bir cerrahi tekniktir. Povidon iyot ve etanol ile sterilize zaman periton tahriş olabilir (etanol) ile son yıkama, povidon iyot kaldırır emin olun. Vas deferens için erişimi de skrotum veya karın ⁸ bir çapraz kesi gerçekleştirerek elde edilebilir. Skrotal kesi nedeniyle gerekli nispeten daha küçük insizyon ve biraz daha iyi postoperatif davranış ¹¹ abdominal kesi transversal tavsiye edilmiştir. Iki kez aynı vaz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.