Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Özet

Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca ^{2 +} sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.

Özet

Hücre içi Ca ^{2 +} sinyalleri sık floresan Ca ^{2 +} göstergesi boyalar ve mikroskopi teknikleri ile incelenmiştir. Bununla birlikte, Ca ^{2 +} görüntüleme de niceliksel veri analizi, zaman alıcı ve önyargı tabidir. Ilgi (ROI) algılama bölgeye dayalı otomatik sinyal analizi algoritmaları tek boyutlu çizgi tarama ölçümleri için uygulanan olmuştur, ama iki-boyutlu görüntü dizilerinin optimize kimlik ve İB'nin analizini entegre hiçbir geçerli algoritma yoktur. Burada, resim dizilerinin hızlı elde edilmesi ve ROI analizi için bir algoritma tarif edilmektedir. Bu elips optimum ROI yerleşimini belirlemek amacıyla gürültü filtre sinyallerine uygun kullanır, ve genlik, süre ve mekansal yayılma Ca ^{2 +} sinyal parametrelerini hesaplar. Bu algoritma ImageJ (NIH) bir yazılım için serbestçe kullanılabilir eklenti olarak hayata geçirildi. Birlikte açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar için yazılmış analizi komut ile,Bu yaklaşım, deneysel çıktı hızlı istatistiksel analiz yapmak için yüksek kapasiteli bir boru hattı sağlar. Yazarlar bu analiz protokolün kullanımı fizyolojik Ca ^{2 +} sinyal bir daha tam ve tarafsız karakterizasyonu yol açacağını göstermektedir.

Giriş

Ca ^{2 +} molekülü ve sitozolik Ca ^{2 +} düzeyleri yüksek regüle edilen sinyalizasyon bir yerde ikinci bir elçisidir. Hücre içi Ca ^{2 +} sinyalleri karmaşık ve izole geçişlerini, salınımlar ve dalgalar ¹ çoğaltım dahil ^{- 4.} Ca ^{2 +} mekansal ve zamansal kontrol Fizyolojik sinyal özgüllüğünü altında yatan düşünce, ve bu nedenle Ca ^{2 +} sinyal şekillerinin analizi birden fazla alanlarda ⁵ araştırmacılara büyük ilgi olduğunu.

Bu tür Flu-4 ve Fura-2 ile Ca ^{2 +} göstergesi boyalar genel olarak ^5-12 floresan mikroskobu ile hücre içi ^{Ca2 +} sinyalleri ölçmek için kullanılır. ^{16 -} Genellikle, geçici Ca ^{2 +} sinyalleri zamana bağımlı kullanıcı tanımlı bir alanda ortalama floresan değişiklikler, ya da ilgi bölgesi (ROI) ^5,6,13 olarak değerlendirilir. Şu anda, manuel ROI analizi zaman alıcı ve emek hem de bir^{19 -} birçok İB'leri belirlemek ve tekrarlayan hesaplamaları ¹⁷ gerçekleştirmek için kullanıcılar gerektirir çünkü da oldukça kapsamlıdır. Bu teknikler aynı zamanda yapay sinyal modları ve düşük genlikli veya yaygın sinyallerinin ^18,20 dışlanma tanıtımı dahil olmak üzere, önemli kullanıcı hatası tabi olabilir.

^, Otomatik ROI algılama algoritmaları önceden optimum ROI yerleşimi belirlemek için istatistiksel yaklaşımlar çeşitli kullanarak uygulanan olmuştur, ama genellikle çizgi tarama ya da sözde-line zaman ¹⁷ tek bir mekansal boyut analizi kısıtlar tarama görüntüleri analiz sınırlı olmuştur ^19-22. Ayrıca, birçok mevcut algoritmaları Ca periyodik, lokalize transientler dan yayılan dalgalar ^23,24 aralığında ^{2 +} serbest olaylar çeşitliliğini kapsayacak şekilde yeterli değildir. Fizyolojik Ca ^{2 +} sinyalleri kapsamlı değerlendirme genellikle daha önemli görüntü artif varlığı ile komplikebirçok deneysel sistemlerde gürültü ayrımcılığa sinyalini karıştıran hareket.

Daha önce, Ca otomatik ROI algılama algoritması çözüm ^{2 +} (Sağlık, Bethesda, MD National Institutes), gelişmiş ve ^25,26 valide NIH ImageJ yazılım için bir eklenti olarak uygulanan geçici algılama sinyal. LC_Pro denilen Bu algoritma, iki-boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri Ca ^{2 +} sinyal geçişlerini kapsayan İB'leri tanımlamak ve analiz etmek için tasarlanmıştır. İşte pratik bir deneysel protokol ve domuz koroner arter endotelyumda algoritmanın bir uygulama temsili gösteri kullanılabilir grafik çıktısı oluşturmak için açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar kullanarak ek komutlar ile sağlanır.

Protokol

1.. Gemi Diseksiyon ve Görüntüleme

1. Martens ve diğ ²⁷ de tarif edildiği gibi iç çocuk domuz Hasat doku. Bir polidimetilsiloksanın (PDMS) HEPES fizyolojik tuzlu su solüsyonu (PSS) tamponlu içeren alt diseksiyon çanak içine hasat domuz sağ ventrikülleri yerleştirin.
   1. Bir stereomikroskopta yardımıyla, incelemek ve çevre kardiyak doku katmanlarından damar segmentini kaldırarak forseps ve yaylı makas kullanılarak çevreleyen dokudan koroner arter (~ 8 mm uzunluk, 0.5 mm çap) sol ön inen bir bölümünü kaldırın. NOT: damar duvarı delmek değil dikkat edin.
   2. Diseksiyon çanak içine PDMS bloğu (1 x 0.5 x 0.5 cm) yerleştirin, ve alt iğnelemekle bir iğne kullanın. Mikro iğnelerin şekillendirme, oniki ~ 0.3 cm uzunluk kesimleri içine yaklaşık 40 mikron çaplı tungsten tel kesme ve çanak bu yerleştirin. Forseps kullanılarak, bir micropi ile blok damar segmentinin bir ucunu güvenlin.
   3. Dikkatle damar lümenine küçük yaylı makas yerleştirin ve tamamen açmak için geminin bir tarafında aşağı uzunlamasına kesilir. Endotel yukarıya açılan damar segmentini yönlendirin.
   4. Damar düz bir dikdörtgen oluşturur, öyle ki engellemek için açılan damar segmentinin sınırları güvence altına almak için, geri kalan mikro iğnelerin kullanın. NOT: Micropin üstleri 90 ° eğildi ve blok yüzeyi ile aynı hizada kadar takılmalıdır. Care gerilmeden olmadan damar hazırlık uzatmak için alınmalıdır; Nihai genişliği ~ başlangıç ​​esnetilmemiş genişliğini 1.5x edilmelidir.
   5. 134 NaCl, KCl 6: a HEPES içinde pluronik (% 0.03) ile DMSO içinde çözülmüş Fluo-04:00 (10 uM) karıştırılarak Fluo-04:00 yükleme çözeltisi küçük bir hacmi (~ 1 ml) hazırlayın mM ihtiva eden PSS (tamponlu , 1 MgCİ, 10 HEPES, 10 glukoz) ve karanlıkta oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika boyunca yükleme çözeltisi içine bütün bir blok yerleştirin.
   6. Yükleme işleminden sonra, HEPES tamponlu blok yıkayın5-10 dakika için PSS.
   7. HEPES PSS'ye tamponlu içeren bir coverglass alt odasına 50-100 mikron kalınlığında ayırıcılar üzerine bloğunu monte edin. NOT: Metal pimler ayırıcılar olarak kullanılan ve damar segment aşağı bakacak ve aralıklarına değmiyor emin olabilir.
   8. Konfokal görüntüleme için donatılmış bir inverted mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve endotel hücre tabakası üzerine odaklanır.
   9. ~ 3 20X büyütme dakika ve konfokal görüntü sırası aquisition yazılımını kullanarak saniyede ~ 8 kare hızı için bazal göreceli floresan yakalama zaman atlamalı görüntü dizileri.
   10. Bazal floresans kayıt ~ 3 dakika sonra, bir HEPES addtional 3 dakika için aynı tampon HEPES içinde PSS çözündürüldü, Madde P (100 pM) hacimle (~ 1 ml), ve bir kayıt ile PSS tamponlu çözelti değiştirin.

2.. Otomatik Analizi

1. 8 bit, g konfokal toplama yazılımı floresan kalsiyum aktivitesinin görüntü dizisi (ler) RenderHiçbir ölçekli bilgi rayscale '. tif' formatındaki dosyalar.
2. Açık ImageJ, dosya menüsünde 'açık' tıklayın ve ImageJ görüntü dizisi (ler) görüntülemek için explorer penceresinde uygun görüntü dizisini seçin.
3. Görüntü sekans (lar) içinde faaliyet mekansal yayılma üst ve alt sınırları tahmin etmek için dikdörtgen ROI aracını kullanarak, uygun bir ROI çapı belirler. NOT: ortalama dikdörtgen çapı ROI çapı için uygun bir seçimdir.
4. Bilgisayarın sabit sürücüsünde yeni bir klasör oluşturun ve klasörü dizine görüntü dizisi (s) ekleyebilirsiniz.
5. ImageJ, 'Eklentiler' penceresini tıklayın, ardından analizi başlatmak için 'LC_Pro tıklayın.
6. ROI çap değerini girin ve filtre eşik değerini (0.05 veya 0.01) seçin.
7. 'Ilaç tedavisi' onay kutusunu tıklayın ve hemen önce ve sonra ilaç ilave edildi (saniye) zaman noktası değerleri girin.
8. 'Tamam' düğmesini tıklayın vedosya gezgini penceresine görüntü dizisi dizini girin.

3.. Grafik Çıktı

1. Den R sürüm 3.0.2 indir http://www.r-project.org/ .
2. R. 32 bit sürümünü açın
3. "Dosya", daha sonra 'açık komut tıklayın ve grafiksel deney raporları oluşturmak için' traceplot.R 'R komut seçin.
4. 'Paketler' seçerek kalibre ve gplots paketleri yüklemek, 'paketleri yüklemek', ve uygun sistemlerin paketleri seçerek.
5. 'Change directory' komutu ardından, 'dosya' tıklayın ve LC_Pro analiz çıkışına karşılık dizini seçmek için kaşif penceresini kullanın.
6. Komut penceresinde tıklatın ve sonra da 'çalışan tüm' komut dosyasını çalıştırmak için komut.

Sonuçlar

Özel bir algoritma, LC_Pro, gelişmiş ve Ca otomatik analizini gerçekleştirmek amacıyla hayata geçirildi konfokal görüntü dizileri üzerinde ^{2 +} dinamikleri. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, algoritma A) algılar ve dinamik Ca parça siteleri ardışık işleme modülleri kullanır ^{2 +} <0.01), gürültü, B) aktif bölge merkezlerinde otomatik olarak (ROI) bölgeleri tanımlar ve istatistiksel (p yukarıda değiştirmek C) Belirli bir olay parametreleri belirlemek ...

Tartışmalar

Hücresel ve çok hücreli düzeyde karmaşık Ca ^{2 +} sinyalleri çözme titiz deneysel ve analitik yaklaşımlar gerektirir. Burada, bir yaklaşım Ca ^{2 +} bağımlı floresans çözülmesi konfokal resim dizileri sunulan spesifik durumda sağlam hücre alanları içinde istatistiksel olarak ilgili Ca ^{2 +} sinyalleri tespit eder ve miktarını belirler otomatik analizine tabi tutulur ve bu süre de açıklanan, bir arter kademeli bir izole edildi domuz kalbinden, tutturulmuş konfokal gö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing