간 전이의 전임상 쥐과 모델

요약

간 전이 전임상, 뮤린 모델 hemispleen 주입 기법을 통해 수행 하였다.

초록

수많은 뮤린 모델은 인간의 암 연구 및 암 치료 및 개발의 이해를 발전하기 위해 개발되어왔다. 여기서, 동계 생쥐 췌장 종양 세포의 주입 hemispleen 통한 간내 전이 전임상, 쥐 췌장 종양 모델을 설명한다. 이 모델간에 전이성 질환을 가진 환자에서의 임상 조건의 많은 모방. 마우스는 지속적으로 전이 과정의 조사, 실험적인 치료 테스트 및 종양 면역학 연구를 허용 간에서 전이을 개발한다.

서문

췌장 유관 선암 (PDA)는 미국 ^한 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인이다. 전이성 PDA 환자 5 년 생존율은 2-12% ^일이다. 췌장암에 대한 보조 및 보조 항암 화학 요법이 그 어느 때보 다 오늘날 더 효과적이지만, 여전히 새로운 치료를위한 절박한 필요성이 남아있다.

신규 한 치료제의 개발을 신뢰성 전임상 동물 모델을 필요로한다. 피하 종양 모델은 사용하기 간단하지만, 단점은 인간의 암에서 볼 수있는 종양의 진행과 미세 환경을 전이하고 모방하는이 종양의 무능력을 포함한다. 같은 Kras 호텔 및 p53의 노크에 발암 돌연변이 (KPC 모델) ^(2)와 YFP 계보 추적 (PKCY 모델)와 KPC 모델을 포함하는 유전자 변형 마우스와 같은 유전자 조작 모델, ³ immunocompete에서 자연적으로 발생하는 종양에 대한 연구 허용NT 마우스. 또한, 종양 미세 환경은 불변이고 더 밀접 인간 종양 진행에서 본 것을 닮았다. 불행하게도, 종양 발생의 타이밍 어려운 실험 요법을 연구 할 수있다 이러한 모델 내의 변수이다. 또한,이 마우스의 교잡 시간과 항상 가능하지 않을 금융 약속, 상당한 양을 필요로한다. 마지막으로, 이식 이종 이식 PDA 마우스 모델을 변경 한 마우스, 결석, 종양 미세 환경을 면역이 필요로. 따라서 이러한 전임상 모델에서 입증 실험 요법의 효능은 종종 인간 임상 시험에서 ⁴ 재현성 아니다.

이 hemisplenectomy 마우스 모델 C57BL / 6 마우스 ^{(5, 6)로부터} 유도 고도로 종양, 췌장 종양 methylcholanthrene 유도 세포주이다 Panc02 종양 세포를 이용한다. 또한, 다른 PDA 뮤린 세포주 KPC 마이크에서 파생전자는이 모델에서 사용될 수있다. Schulick 등. 이전에 hemisplenectomy 기술을 개발하고 대장 암의 전이 ^(7)의 동계 마우스 모델을 만들었습니다. 이 hemisplenectomy 모델 (그림 1)는 새로운 치료제 ^7-10의 조사 자체를 빌려주는 면역 생쥐에서 일관되고 동일한 종양 접종을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 존스 홉킨스 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 가이드 라인을 따른다, 동물은 평가 및 실험실 관리의 인증 (AAALAC)에 대한 협회의 가이드 라인에 따라 유지 하였다. 수술은 시간당 십오 공기 교류 최소 거친다 수술실에서 멸균 조건 하에서 수행된다. 모든 악기는 절차 중에 전에 각 마우스 사이에서 70 % 에탄올로 순서에 다시 오토 클레이브에 의해 살균된다. 수술 살아남을 것으로 예상되지 않은 모든 마우스는 마취 여전히 동안 자궁 경부 전위 다음 3 분 동안 CO _2에서 안락사된다.

1 셀 준비

1. 이 X10 ⁷ 세포 / ml에서 인산염 완충 식염수 Panc02 배양 세포를 재현 탁하고 얼음에 보관.

2 마우스 준비

1. Ketamin를 관리자일 라진 (xylazine) (10 ㎎ / ㎏)와 혼합 전자 (100 ㎎ / ㎏)을 복강에 8-12주 나누어 오래 된 C57BL / 6 마​​우스 여성.
2. 발가락 핀치 금단 반사가 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인하기 위해 폐지되어 있는지 확인하십시오.
3. 완전히 쥐를 마취 할 필요 자일 라진 (xylazine) (10 ㎎ / ㎏)와 혼합 케타민의 추가 용량 (100 ㎎ / ㎏)을 관리합니다.
4. 쥐가 마취 동안 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 Puralube 수의사 연고를 적용합니다.
5. 상처의 오염을 방지하기 위해 마우스의 외과 영역을 면도.
6. 요오드 후 70 % 에탄올과 함께 절개의 좌측 영역 subcostal 수험.
7. 불임을 유지하기 위해 복부 수술 드레이프를 놓습니다.

3 개복술

1. 피부를 통해와 메스를 사용하여 복막을 통해 왼쪽 귀 라인에 왼쪽 subcostal 절개를합니다.
2. 동시에 디지털 페이지를 적용하여 절개를 통해 비장을 표현절개의 뇌와 꼬리 부분을 따라 ressure.
3. 비장의 하부 끝에 비장 혈관을 찾습니다.
4. 비장 극의 비장 혈관이 손상되지 않도록주의하면서 비장의 중심이 지평선 중간 크기 결찰 클립을 배치하여 비장을 나눈다.
5. 오염을 방지하기 위해 다시 복막에 비장의 상극을 놓습니다.

4 종양 주입

1. 26 G X 8 "주사기에 인산염 완충 생리 식염수 150 μL를 그립니다.
2. 주입하는 동안 항상 수직 위치에 주사기를 유지 같은 주사기로 100 Panc02 ㎕의 (2 X10 ⁶⁾ 세포를 그립니다.
3. 70 % 에탄올 용액에서 바늘을 찍어. 바늘은 멸균을 위해 70 % 에탄올에 침지된다.
4. 주사기가 항상 수직으로 유지되어 있는지 확인되는 노출 hemispleen로 천천히 세포를 주입한다. syrin의 경사GE는하에 비장 세포를 주입 피하기 위해 비장 캡슐을 항상 지켜 져야한다. 비장과 혈관의 미백 주사에 관찰해야한다.
5. 비장을 상승 및 비장 혈관을 폐색하는 비장에서 한 매체 지평선 클립을 적용합니다.
6. 췌장 및 비장 혈관의 가장 후방 측면에 하나의 작은 지평선 클립을 적용합니다.
7. 지평선 클립 위에 절단하여 hemispleen에서 췌장 및 비장 혈관을 결찰.
8. 그 '측에 마우스를 놓고 증류수로 절개를 관개.

마취에서 5 복부 폐쇄 및 복구

1. 4-0 실행 스티치로 복막을 닫습니다.
2. 피부 절개를 닫 2-3 피부 클립을 적용합니다.
3. 포스트 수술 통증을 완화하는 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀 또는 5 ~ 10 ㎎ / ㎏ Carprofen 피하을 관리 할 수​​ 있습니다.
4. REC위한 가열 패드에 마우스를 놓고overy 이동까지 마우스가 규칙적인 호흡 패턴을 보여줍니다. 동물은 완전히 수술에서 회복 한 후 다른 동물의 회사에 반환됩니다.

6 부검 검사 및 간의 수확

1. 수술 후 30-60일 사이에, 마우스는 전이의 임상 증상을 표시하기 시작하고 안락사가 필요합니다. 인도적인 안락사를 요구하는 전이성 질병의 징후 확대 복부와 복수의 개발을 포함한다. CO _2의 흡입에 의해 쥐를 안락사.
2. 흡입 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
3. 동물이 아닌 응답 것으로 판정 된 후, 가위를 사용하여 복부를 노출 복막을 통해 절개.
4. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게 복부에서 간을 잘라.
5. OCT 화합물의 간을 놓고 플래시는 액체 질소를 사용하여 동결. -80 ° C에서 간을 저장합니다. 대안 적으로, 라이브R은 내장 24 시간 파라핀 실온에서 16 % 중성 포르말린에 고정 될 수있다.

결과

hemispleen에 주입 Panc02 종양 세포 기술이 제대로 수행되는 경우 폐, 복막 전이가 관찰되지 않은 반면 (그림 1) 마우스의 100 %의 형태로 간 전이. 이 기술은 여러 개의 독립적 인 실험에서 Panc02 세포를 이용한 백 위에 마우스에 대해 수행되었으며, 재현성, 모든 미처리 마우스 hemisplenectomy 절차 (도 2) 다음 30 60 일 사이의 간전으로 죽는다. 치료 및 치료 그룹 사이에 유의 한 차이...

토론

hemispleen 주입 기법을 통해 간으로 췌장 암전이 전임상 뮤린 모델간에 전이성 질환이있는 환자의 임상 적, 면역 학적 조건 중 많은 거울 설명한 제 모델이다. 이 모델은 다른 쥐 모델에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 쥐의 30 %가 간 및 전이 형성의 타이밍에 전이를 개발하는 췌장암의 형질 전환 모델은 상당히 가변적 달리 먼저,이 모델에서 마우스의 100 %에서 간으로 일관 획득 전이 이점을 제?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251