Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Resumen

Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.

Resumen

Criofractura / congelación grabado describe un proceso por el cual las muestras, por lo general biológico o nanomaterial en la naturaleza, se congelan, fracturar y replicado para generar un carbono / platino "fundido" destinada a examen mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras se someten a la tasa de congelación ultrarrápidos, a menudo en presencia de agentes crioprotectores para limitar la formación de cristales de hielo, con posterior fractura de la muestra en nitrógeno líquido enfría temperaturas bajo alto vacío. La superficie fracturada resultante se replica y se estabilizó por evaporación de carbono y platino desde un ángulo que confiere detalle superficie tridimensional para el reparto. Esta técnica ha demostrado ser particularmente instructivo para la investigación de las membranas celulares y sus especializaciones y ha contribuido considerablemente a la comprensión de la forma celular para la función celular relacionada. En este informe, examinamos los requisitos de instrumentos y protocolo técnico para la realización decongelación-fractura, la nomenclatura y las características de los planos de fractura asociado, las variaciones en el procedimiento convencional, y criterios para la interpretación de las imágenes de congelación de fractura. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para la investigación ultraestructural en muchas áreas de la biología celular y mantiene la promesa como una técnica de imagen molecular emergente de la nanotecnología, y los estudios de la ciencia de materiales.

Introducción

El concepto y la aplicación práctica de procesamiento de congelación-fractura de las muestras biológicas se introdujo por Steere ¹ más de la mitad de hace un siglo. El aparato temprana apropiado componentes dispares en una unidad autónoma de trabajo ^1. El aparato original fue modificado y refinado en instrumentos disponibles comercialmente con el fin de acomodar la necesidad crítica para la manipulación a distancia, el mantenimiento de alto vacío, y la evaporación de carbono y metales para producir una réplica adecuado para el examen por microscopía electrónica de transmisión (Figura 1 y la Figura 2).

El instrumento típico consiste en una cámara de alto vacío con mesa de espécimen y el brazo microtomo tener rendimientos de nitrógeno líquido regulables (Figura 1). La cámara también cuenta con dos cañones de electrones, uno para la estabilización de la evaporación de carbono colocados en un ángulo de 90 º a la platina y el otro para platinum / carbono sombra en un ángulo ajustable, típicamente 15 º - 45 º (Figura 2). Alimentación a la unidad se aplica para accionar la bomba de vacío y paneles electrónicos regular ajuste de la temperatura y de electrones control de armas.

Originalmente concebido como un medio para lograr una mejor imagen de los virus, criofractura ganado aún más popularidad como una técnica para el examen y análisis de las membranas celulares y sus especializaciones ^{2, 3.} De hecho, este procedimiento ha sido parte integral de la aclaración de las relaciones estructura / función en las células y tejidos, y muchos de estos estudios destacan como clásicos contribuciones a la biología celular y molecular ^4-9. El principal objetivo y razón para el desarrollo de la técnica de congelación-fractura era limitar los artefactos observables en la resolución microscópica de electrones derivados de la fijación química y el procesamiento utilizado en microscopía electrónica biológico convencional. Aquí el objetivo es limitar químicala fijación y para congelar la muestra con suficiente velocidad y con frecuencia en presencia de un crioprotector a fin de limitar la formación de cristales de hielo y otros artefactos de congelación. Más recientemente, esta técnica ha encontrado un resurgimiento del interés por parte de los biólogos moleculares y los investigadores de ciencia de los materiales para el examen de las nanopartículas y nanomateriales.

Imágenes criofractura y el embargo preventivo de grabado exhiben un carácter tridimensional y, a veces se confunden con microscopio electrónico de barrido. Sin embargo, los preparativos de congelación de fractura son examinadas por microscopía electrónica de transmisión y de su importante contribución a los estudios morfológicos de alta resolución es su representación única de elementos de estructura / función de las membranas celulares. Procesamiento de congelación-fractura se inicia mediante la congelación de células y tejidos con una velocidad suficiente para limitar la cristalización del hielo y / o con el uso de agentes crioprotectores tales como glicerol. Las muestras son luego fracturaron al vacío y un representantelica se genera por evaporación de carbono y platino sobre la superficie fracturada. El ejemplar original se digiere de la réplica de la que se recupera en una rejilla de muestras estándar de EM. Otra mala interpretación común de las imágenes de congelación de fractura es que representan las superficies celulares. Sin embargo, la premisa básica de congelación-fractura es que las membranas biológicas se dividen a través de la bicapa lipídica por el proceso de fractura (Figura 3). Este proceso en las membranas biológicas produce dos caras de fractura, uno que revela la organización de la media de la membrana adyacente al citoplasma, el PF-cara, y uno que revela la media de la valva bimolecular de la membrana que está adyacente a la extracelular medio, el EF-cara. Superficies celulares verdaderos no están representados en imágenes de congelación-fractura, pero sólo aparecen cuando se utiliza la etapa posterior añadido de congelación-grabado siguiendo el procedimiento de la fractura. Para grabar con eficacia especímenes previamente fracturados para revelar deta superficiel, los especímenes deben congelarse a un ritmo rápido y sin unetchablecryoprotectant. Grabado de agua de la superficie de la muestra fracturadas que revelan características subyacentes se lleva a cabo colocando el brazo microtomo enfriamiento durante la etapa de muestra de la creación de un diferencial de temperatura entre la etapa de celebración de la muestra y el brazo microtomo de enfriamiento que hace que el agua para sublimar de la superficie. Cuando el agua se sublima desde la superficie de la muestra fracturados durante la maniobra de congelación-aguafuerte, a continuación, los aspectos de las superficies reales de células, matriz extracelular, las estructuras del citoesqueleto, y conjuntos moleculares pueden ser revelados a alta resolución. Así por congelación y congelar fractura de grabado no son términos intercambiables sino más bien refleja un proceso paso a paso el último de los cuales puede no ser necesario o deseable dependiendo de las necesidades del estudio particular.

A raíz de la congelación-fractura / congelar-grabado procedimientos, las superficies fracturadas se someten a evapora dirigidosTIVE capas de carbono y platino con el fin de proporcionar apoyo y formación de imágenes de contraste a la réplica. El platino imágenes evaporación / carbono puede ser unidireccional o rotatorio y se lleva a cabo por cualquiera de resistencia o cañones de electrones. Sombreado unidireccional desde un ángulo conocido, típicamente 30 º - 45 º, es útil en la realización de ciertos cálculos morfométricos. Las muestras que han sido sometidos a lo profundo de grabado normalmente son rotatorio sombra y las imágenes resultantes de estos especímenes son fotográficamente invierten para su evaluación.

El histórico, así como una meta actual de la / técnica de congelación de grabado de congelación-fractura es limitar la fijación química y procesamiento de muestras artefactos que están asociados con los procedimientos de microscopía electrónica de transmisión más convencional. Sin embargo, esta técnica proporciona una ventaja sustancial en su capacidad para conferir detalle en tres dimensiones y por lo tanto facilitar la adquisición de los datos morfométricos en biológica, ciencia de los materiales, y nespecímenes anotechnology. Procedimientos criofractura y el embargo preventivo de grabado son complejos y de múltiples facetas y algunos aspectos de su aplicación son personalizados. Esta presentación ofrece una visión encuesta de las principales características del proceso y se remite al lector a los protocolos completos publicados ^{10, 11} con el fin de abordar los detalles y personalizar el proceso para las necesidades específicas de investigación.

Protocolo

1 Preparación de muestras biológicas para criofractura / Freeze-grabado

1. Utilice una formulación convencional fijador EM tales como glutaraldehído al 2% + 2% de paraformaldehído en tampón de fosfato 0,1 M durante 1 hora. para llevar a cabo la fijación primaria de los tejidos biológicos. NOTA: Si bien puede ser deseable para congelar algunos tipos de especímenes sin fijación previa, patógenos transmitidos por la sangre precauciones universales exigen fijación apropiada cuando la muestra se compone de tejido humano.
2. Después de la fijación primaria, enjuagar la muestra en el mismo tampón suplementado con 0,2 M de sacarosa por no más de 1 hr.
3. Transferir la muestra a una solución crioprotector que consiste en 25% de glicerol en tampón de fosfato 0,1 M durante no más de 1 hr.

2. Congelación y almacenamiento de muestras por adelantado de Freeze-fractura

1. Seleccione oro o cobre talones de muestras de tamaño y forma apropiada para la muestra que se procesan (Figura 4 ).
2. Con unas pinzas finas de grado y / o de calibre pequeño de posición agujas de jeringas pequeños fragmentos de la muestra en la parte superior del talón de un espécimen de metal.
   1. Reducir el contenido de líquido de la muestra a un pegajoso, ligeramente pegar consistencia extrayendo líquido desde el borde del talón con papel de filtro.
   2. Para réplicas individuales, utilice pequeñas agujas de jeringa de calibre para crear un montículo de tejido en el talón. Para doble réplicas, invertir otro trozo y colocarlo exactamente sobre el trozo y colocarlo ligeramente sobre la superficie del espécimen creando un sándwich (Figura 5A). No presione la muestra de entre los dos talones.
3. Llene dos vasos Dewar aisladas con nitrógeno líquido. NOTA: El primer buque tiene capacidad para un poste de metal que contiene un pequeño pozo que se utiliza para licuar un pequeño volumen de gas propano de un cilindro disponible comercialmente (Figura 5B). El segundo recipiente es un almacenamiento seccionada / depósito de almacenamiento de brevely mantener muestras congeladas en nitrógeno líquido.
   1. El uso de la boquilla del cilindro colocado en el pozo de propano, abra la válvula del cilindro y permite que el gas fluya hacia el pozo del buque donde se licua. NOTA: ATENCIÓN !! PROPANO ES EXPLOSIVO, PUEDE CAUSAR CONGELACIÓN DE LESIONES EN CONTACTO, Y ES UN ASFIXIANTE. Use sólo con propano en una campana química certificada para tal uso cuidando también de evitar las fuentes de ignición extraños, utilizando prendas de protección contra las temperaturas bajas, y el mantenimiento de una ventilación adecuada.
   2. Lo más rápido posible, recoger la muestra de montaje con unas pinzas finas de grado y se hunden en el gas licuado en el primer recipiente durante varios segundos y luego transferir rápidamente al segundo recipiente de retención de nitrógeno líquido (Figura 5B).
   3. Una vez que las muestras se congelan, almacenan en nitrógeno líquido hasta que esté listo para transferir a la planta de congelación-fractura. Transfiera los talones a un mayor almacenamiento de nitrógeno líquido recipiente Dewar para extendersealmacenamiento, si se desea, sin embargo se debe tener cuidado de no permitir que los talones se descongele.

3. Funcionamiento de la congelación-fractura de procesamiento de instrumentos y muestras

1. Cargando muestras en el soporte de latón y dentro de la cámara
   1. Cargue los talones de muestras de oro en un portamuestras doble réplica de tipo folleto o sujetar el dispositivo en nitrógeno líquido y mantener allí hasta que esté listo para colocar en la cámara de muestra (Figura 6).
   2. Cuando la cámara ha alcanzado alto vacío (aproximadamente 2 x 10 ^-6 mbar) y la etapa se ha enfriado a la temperatura del nitrógeno líquido, apague la bomba, ventilar la cámara, y la posición de las muestras talones monta sobre la mesa muestra lo más rápidamente posible .
   3. Encienda la bomba, restablecer alto vacío, y el uso de los controles de fase y temperatura brazo electrónico para ajustar la temperatura de la tabla de muestras a -100 ° C y el nitrógeno líquido directo al brazo microtomo y bring a la temperatura del nitrógeno líquido.
2. El proceso de fractura
   1. Sobre la realización de alto vacío, una temperatura de -100 º C etapa y el brazo micrótomo a temperatura de nitrógeno líquido, abrir de forma remota el titular doble réplica espécimen fracturando así los ejemplares en los montes de muestras (por congelación fracture_movie1.mov).
   2. En el caso de especímenes destinados para el grabado después de una fractura, utilice una hoja de afeitar mantenido en una abrazadera en el brazo microtomo para afeitarse (es decir, la fractura) de la superficie de los especímenes en lugar de la etapa 3.2.1 (congelar-etch_movie2.mov).
   3. Si la etapa de congelación-aguafuerte añadido se va a realizar, posicionar el brazo microtomo enfriado sobre las superficies fracturadas de uno a varios minutos. NOTA: Esta maniobra sublimar (es decir, etch) el agua de la superficie fracturada. El efecto de esta maniobra es revelar superficies verdaderas células, matriz extracelular, y / o ensamblajes moleculares por sublimación de agua, además de framagen caras de pasar a través de la bicapa lipídica de las membranas.
3. Sombreado metal y apoyo réplica de evaporación utilizando cañones de electrones
   1. Active la pistola de platino / electrones de carbono o la resistencia y deje que se evapore una capa delgada (aproximadamente 2 nm) de platino / carbono sobre la superficie fracturada de un ángulo de 30 º - 45 º. Esto normalmente requiere aproximadamente al 15 - 20 seg.
   2. Activar el electrón de carbono o pistola de resistencia como en el paso 3.3.1 y evaporar una capa delgada de carbono a la superficie de la muestra fracturada directamente desde arriba (90 º) para dar apoyo a la réplica. Esto normalmente requiere aproximadamente al 15 - 20 seg.
4. Recuperación de réplicas
   1. Al finalizar el remedo de replicación y la estabilización de carbono, apague la bomba de vacío, ventilar la cámara, y retire la pieza de montaje del instrumento.
   2. Con un par de pinzas finas grado quitar cada trozo de muestras de oro del dobleréplica de folleto / pinza y dejar descongelar durante varios segundos antes de bajar suavemente el talón sobre una superficie de agua en una placa punto (Figura 7). NOTA: La réplica de carbono / platino que contiene material de muestra adherente flotará sobre la superficie del agua.
   3. Maniobrar las réplicas utilizando ya sea un bucle de alambre fino o una rejilla de microscopio electrónico de cobre convencional en poder de fórceps grado fino y la transferencia a otro punto de la placa que contiene 5% de dicromato de sodio en ácido sulfúrico al 50% durante una a varias horas. NOTA: Este baño digiere el material de muestra biológica real de la réplica. Fuerza completa cloro de uso doméstico puede ser sustituida por la solución de ácido dicromato / sulfúrico.
   4. Cuando la digestión es completa, transferir la réplica de nuevo a una superficie de agua limpia y recuperar en una rejilla estándar de microscopía electrónica de cobre. (NOTA: Réplicas puede fragmentarse en trozos más pequeños durante la digestión, sino incluso muy pequeñas réplicas puede contener información importante y debería ser retrieved y examinado.) réplica tienda apoyando rejillas en cajas de la red disponibles en el mercado donde permanecerán estables durante años con un manejo suave.

4. ultraestructural Examen de criofractura / Réplicas de grabado

1. Ver réplicas en un microscopio electrónico de transmisión a un voltaje de aceleración típicamente 50 a 80 kV.
2. Graba imágenes relevantes sobre la película TEM estándar o con una cámara digital de alta resolución.

Resultados

La premisa fundamental de la interpretación de imágenes de criofractura es que los planos de fractura pasan a través de la bicapa lipídica de las membranas que confieren dos caras de fractura, llamada por convención el PF-cara (plasma fractura-cara) y EF-cara (fractura-cara extracelular) (Figura 3). El PF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al citoplasma de la célula y el EF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al medio extracelular. La téc...

Discusión

En los años siguientes a su introducción y disponibilidad comercial, congelación-fractura / procedimientos de grabado fueron ampliamente utilizados para investigaciones de la estructura de la membrana biológica. De hecho, las mejores perspectivas de algunas de las especializaciones estructurales de las membranas se han obtenido en las preparaciones de congelación-fractura / Etch. Estos estudios no sólo han contribuido a la comprensión de la organización estructural de las membranas, pero también proporcionaron ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.