16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

요약

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

초록

미생물 생태학의 주요 질문 중 하나는 "사람이 있습니까?"입니다이 문제는 다양한 도구를 사용하여 대답하지만, 오래 지속 골드 표준의 한 도메인 수준 PCR에 의해 생성 된 16S 리보솜 RNA (rRNA의) 유전자 증폭 산물을 시퀀싱하는 것입니다 수 있습니다 게놈 DNA에서 증폭 반응. 전통적으로, 이는 클로닝 및 생거 (모세관 전기 영동) PCR 증폭 산물의 염기 서열에 의해 수행되었다. 차세대 시퀀싱의 출현 대단히 단순화 및 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대한 서열 깊이를 증가했다. 벤치 탑 시퀀서의 도입은 이제 작은 실험실 일 만에 사내들은 16S의 rRNA의 염기 서열을 수행 할 수 있습니다. 여기서, 벤치 탑 차세대 시퀀서를 사용하여 16S rRNA의 유전자 앰플 리콘 서열에 대한 접근은 상술된다. 환경 적 DNA 서열은 제 어댑터 및 바코드를 함유 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭된다. 그런 다음 에멀젼 PCR을 통해 구형 입자에 결합된다. 입자 리터 아르일회용 칩 oaded 및 칩 시퀀싱이 수행 된 후, 시퀀싱 기계에 삽입된다. 시퀀스는, fastq 형식으로 검색 필터링 및 바코드는 읽기의 샘플 구성원을 설정하는 데 사용됩니다있다. 다음 더 공개적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 분석 읽기 여과하고 비닝. 읽기 예 분석 Mothur가 주어진 소프트웨어 패키지 내의 분류법 탐지 알고리즘으로 분류 하였다. 여기에 설명 된 방법은, 간단하고 저렴 간단하며 지속적인 게놈 혁명에서 활용할 작은 실험실을 도와야한다.

서문

그것은 환경 적 시료에 함유 된 유전 정보의 전체를 대상으로 Metagenomic 시퀀싱은 아주 강력한 기술이다. 샷건 시퀀싱, 대형 삽입 라이브러리와의 amplicon 시퀀싱을 포함 metagenomic 시퀀싱의 다른 맛이있다. 앰플 리콘 서열은 일반적으로 정렬 될 수있는 하나의 게놈 영역에서 상대적으로 저렴하고 빠른 판독 생산할 수있는 장점을 제공한다. 또한, 앰플 리콘 시퀀싱 데이터 분석 워크 플로우는 주로 표준화된다. 이 PCR에 기초하기 때문에, 모든 불완전한 특이성, 불완전한 커버리지 및 프라이머에 관련된 바이어스 기껏 반 정량이 접근하게 ^1,2, 편향을 갖는다. 몇몇 게놈 영역은 기능적 유전자 앰플 리콘을 포함한 시퀀싱의 대상이 될 수 있지만, 가장 인기있는 옵션 커뮤니티 프로파일을 생성하는 등의 16S rRNA 유전자 등 마커 유전자를 사용한다. 전통적으로, 16S rRNA 유전자의 앰플 리콘 sequencing는 E.에 클로닝 포함 노동 집약적 기술을 사용하여 수행 대장균, 식민지 따기와 격리 된 플라스미드에 생거 시퀀싱 다음 플라스미드 추출, 그리고, 결과적으로 대부분의 연구는 샘플 당 100 개 미만의 클론을 분석했다. 차세대 염기 서열은 두 가지 주요 발전을 가져왔다 : 가장 중요한 시퀀싱 반응과의 대규모 병렬, 템플릿의 클론 분리를 호스트에 유전자 조각을 삽입 할 필요없이. 이것은 대단히 16S rRNA의 유전자의 증폭 서열 ^3에 대해 "르네상스"의 결과로, 이제 다시 많은 환경 미생물 연구의 일상적인 기능을 그대로 16S rRNA 유전자 증폭 산물의 염기 서열을 단순화했다.

2005 년 ⁴ 로슈 454 서열의 출현 이후, 다른 여러 차세대 시퀀싱 기술은 시장에 등장했다 (예를 들면, Illumina 사, 고체, PacBio). 벤치 - 탑 시퀀스의 최근 소개RS는 작은 실험실에 큰 시퀀싱 센터에 한 번 독점적 시퀀싱 용량을 가져왔다. 다섯 벤치 탑 시스템은 현재 사용할 수 : 454 GS 주니어, 이온 토렌트 개인 게놈 머신 (PGM)와 양성자, 그리고 일루미나 MiSeq와 NextSeq (500) 모든 시퀀서 덜 제공하는 대부분의 풀보다 실행 및 달러 당 더 적은 기지 당 읽는 동안 스케일 시퀀서들은 빠르고 더욱 유연하고, 낮은 취득 및 실행 비용이 작은 학술 실험실들이 경제적 만든다. 연구의이 유형은 일반적으로 염기 서열의 극단적 인 깊이를 필요로하지 않기 때문에 벤치 탑 시퀀서는 특히, 환경 미생물 연구의 증폭, 작은 게놈과 낮은 복잡성 metagenome 염기 서열에 적합하다. 예를 들어, 일반적으로 16S rRNA 유전자 염기 서열이 수를 연구에 수백만이 데이터 세트 ^5를 읽어와 같은 패턴을 생성 할 수 있습니다 읽기 1000 ~로, 샘플 당 읽고 답은 아니라고보고있다. 그런 말로 미루어 보아, 벤치 탑 차세대 generatio N 시퀀서는 여전히의 최대 수율 시퀀스 많은 양의 데이터를 생성 ~ 35 MBP (454 GS 주니어) ~ 2 일 GBP (이온 토렌트 PGM) ~ 10 ~ 15 일 GBP (이온 토렌트 양성자) ~ 10 일 GBP (Illumina의 MiSeq) 대부분의 환경 미생물학 연구에보다 더 충분하다 ~ 100 GBP (Illumina의 다음 서열 번호 500).

벤치 탑 시퀀서를 사용하여 16S rRNA를 증폭 산물의 차세대 시퀀싱은 최근 다양한 환​​경에 적용되었다. 예를 들어, 이온 토렌트 PGM이 사회를 위해 사용 된이 오일 샌드 광산의 영향 퇴적물의 탄화수소 오염 북극 토양 ^8,9의 양식 체계 ^(7), 순환의, 특히 높은 pH와 낮은 투과성 ^{6 있었다} 우라늄 광산 찌끼의 분석 인간과 동물의 몸의 ^{13 ~ 16,} 오염 된 토양 ^(12)에 심은 버드 나무의 혐기성 소화조 ^(17)의 근권의 Athabasca 강 ^{(10, 11)에서} 생물막 (biofilm).

이 공헌 우리 세부 벤치 탑에게 차세대 시퀀서 (이온 토렌트 PGM)를 사용하여 사내 16S rRNA 유전자 증폭 산물을 순서에 우리의 접근 방식에서 jove_content ">. DNA 추출 후, 16S rRNA의 유전자가 포함 된 도메인 수준 세균 프라이머를 사용하여 증폭 시퀀싱 어댑터와 독특한 샘플 특정 시퀀스 (바코드)가. 증폭 산물이 몰 비율로 정제 정량화 및 풀링됩니다. 풀링 된 샘플은 다음 clonally 에멀젼 PCR 증폭 및 염기 서열됩니다. 결과 시퀀스는 (공개 생물 정보학 도구를 사용하여 분석 예를 들어, Mothur).

프로토콜

퓨전 방법으로 1 16S rRNA의 유전자의 증폭 도서관 준비

1. 5'-CCT CTC :;, 역 R533-IonP1 5'-CCA TCT의 CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '프라이머 (포워드, F343 - 오 - MIDXX 해동 TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 'AT TAT GGG CAG TCG GTG, 굵은 이온 토렌트 특정 어댑터, 이탤릭체 :; 일반 글꼴 시퀀싱 실행의 시작 부분에 신호 강도를 교정에 대한 염기 서열 키 : 템플릿 특정 프라이머, X를 ... X : 10 염기쌍의 바코드를 바코드 일부 서열은 표 1 참조), 2X HotStartTaq 플러스 마스터 믹스 및 샘플. 부드럽게 혼합한다 마스터 믹스를 제외하고, 사용 전에 완전히 혼합.
2. 역방향 프라이머 0.5 μM, 0.4 밀리그램 / 소 혈청 알부민 (BSA) 1 배 HotStartTaq 플러스 마스터 믹스의 ML과 PCR 믹스 (20 ㎕의 반응을) 준비합니다. 이메일에 마스터 믹스의 18.5 μl를 추가ACH PCR 튜브.
3. 함께 시퀀싱 될 샘플들 각각에 대해 서로 다른 바코드 정방향 프라이머 (20mM의​​ 0.5 μL)에 추가. PCR 튜브에 샘플 1 μL (1 ~ 10 NG / μL)를 추가합니다.
4. PCR 기계에 튜브를 삽입하고 다음 프로그램을 실행시킵니다 5 분 동안 95 ° C에서 초기 변성; 30 초 동안 95 ° C의 25주기, 30 초 동안 55 ° C와 45 초 동안 72 ° C; 10 분 동안 72 ° C에서 최종 신장. PCR 제품은 4 ° CO 유지 / N 또는 사용할 때까지 동결 할 수 있습니다.

2 앰플 리콘 정제, 정량화 및 풀링

1. 가장 큰 빗 사용할 수를 사용하여 2 % 아가 로스 젤을 준비합니다. 물론 빈에 의해 각각의 샘플을 분리, 겔 반응 및 부하에 6 배 젤 로딩 염료의 5 μl를 추가합니다. 50 분 동안 70 V에서 젤을 실행합니다.
2. 겔의 사진을 가지고 밴드를 잘라 (250 bp의 주위에 예상 크기 : 190 bp의 제품 플러스 63 bp의 어댑터 및 바코드) 깨끗한 메스를 사용합니다.
을 절제 밴드를 달아 (예 :와, 제품, QIAquick 젤 추출 키트) PCR 제품의 겔 추출 및 정제를 진행합니다.
3. PicoGreen 각 PCR 제품을 정량화하고 5 × 10 ⁹ 분자 / μL (약 1 NG / μL)에서 원액을 얻기 위해 희석합니다. 몇 가지 샘플이 낮은 증폭을 표시하는 경우, 이후의 절차에 적합한 가장 낮은 농도가 1.57 × 10 ⁷ 분자 / μL (26 일 오후)임을 염두에두고, 낮은 농도로 희석을 조정합니다.
4. 각각의 희석 된 PCR 생성물의 풀 10 μL 샘플의 등몰 풀을 얻었다. 계획 순서 실행의 각 하나의 별도의 풀을 준비합니다. 사용할 때까지 풀링 된 PCR 생성물은 냉동실에 보관 될 수있다.

3 에멀젼 PCR 및 시퀀싱

1. 유화 PCR을 수행
   1. 25 μL의 볼륨에서 26 시까 풀링 된 PCR 제품을 희석. 이온 PGM 템플릿 키트에서 해동 시약.
   2. PCR 후드 에멀젼 PCR 믹스 (키트에 제공된 시약)을 준비하고 벤치에 풀링 된 PCR 제품과 (제공) 구 입자를 추가합니다. 철저하게 믹스와 필터 카트리지에 혼합물을 넣고 조심스럽게 유화 오일 맨 (제공).
   3. 천천히 자동화 된 에멀젼 PCR 장치 (예를 들면, 이온 원터치이 악기)의 필터 카트리지 및로드 역. 해당 프로그램을 선택하고 절차를 시작합니다.
2. PCR이 완료된 후 자동 에멀젼, 수집 튜브의 상등액을 제거하고 관의 하단 구 입자를 검색. (키트에 제공된) 세척 용액 100 ㎕의 구체를 재현 탁 및 라이브러리 정량 2.0 μL 나누어지는 가져 가라.
3. 라이브러리 정량화를 수행합니다.
   1. SSPE 버퍼 (150 mM의 염화나트륨, 10mM을 나포 _4, 1mM의 나 ₂ -EDTA) 어댑터 B'-식구의 2 μL (와 5'-FAM -ct의 100 μl를 혼합G AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') 프로브 및 어댑터 A-Cy5에 2 μL (5'-Cy5에 -CCA TCT의 CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') 프로브. 단계 3.2에서 찍은 2.0 μL 나누어지는이 혼합물의 52 μl를 추가하고 정량 빈으로 나머지 52 μL에 (템플릿 키트) 세척 용액 2 μl를 추가합니다.
   2. 2 분 동안 37 ° C에서 다음 2 분 동안 95 ° C에서 품어. 1.5 ml의 튜브 혼합물을 전송합니다.
   3. 실온에서 3 분 동안 15,500 XG에서 TEX 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, 0.01 % 트리톤 X-100, 산도 8.0) 1.0 ㎖를 섞어 추가하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 각 튜브에 20 μl를 둡니다. 이 세척 과정을 두 번 반복합니다.
   4. , TEX 버퍼의 180 μl를 추가 고형 입자를 재현 탁하고 500 ㎕의 큐 비트 튜브에 전송할 수 있습니다.
   5. 큐빗 장치를 이용 FAM 및 Cy5에 대한 형광을 측정하고 이온 커뮤니티 웹 사이트에서 확인할 수 계산기를 사용하여 포지티브 분야의 비율을 계산.
4. 자동화 농축 시스템 (예를 들어, 이온 원터치 보충 시스템)를 사용하여 (증폭 된 DNA를 포함)에 대한 긍정적 인 구체 구 입자의 나머지 부분을 풍부.
   1. 제공된 8 웰 스트립의 적절한 우물에 피펫 시약 : 음 1 단계 3.2에서 구형 입자; 이 음 : MyOne 스트렙 타비 딘 C1 구슬 (13 μl를) 미리 세척; 그런데 3, 4, 5 : 세정액 (템플릿 키트에 제공됨); 6 음 : 빈; 음 7 : 용융 오프 용액 (125 mM의 수산화 나트륨, 0.1 % 트윈 20)으로; 음 8 : 빈.
   2. 피펫의 팔에 팁과 시료 채취를위한 0.2 ML 튜브를 설치합니다. 악기를 시작합니다. 농축의 끝에서, 용액 (제공)를 중화의 10 μl를 추가합니다. 풍부한 구슬은 최대 15 일 동안 4 ° C에서 유지 될 수있다.
5. 시퀀싱 기기를 초기화합니다 :
   1. 시퀀싱 실행의 세부 사항을 지정하여 시퀀싱 기기에 연결하고 시퀀싱 실행 계획을 준비합니다.
   2. 설치된의L 세척 용액 # 2 (이온 PGM 시퀀싱 키트에 제공됨), 세척 용액 # 1 (350 ㎕의 100 mM의 수산화 나트륨) 및 자동 pH 완충 용액 (제공).
   3. 초기화 절차를 시작하는 경우는 각각 50 ㎖의 튜브으로 dATP, dGTP를 dCTP 및 dTTP의 뉴클레오티드를 (제공)를 추가하라는 메시지가. 시퀀싱 기계에 관을 나사 및 초기화 절차를 계속한다. 초기화가 완료되면, 즉시 실행 절차를 시작한다.
6. 순서를 위해 샘플을 준비하고 칩을로드 :
   1. 1.5 분 동안 15,500 XG에서 원심 분리하여 튜브의 하단에 3.4 단계에서 농축 분야를 수집합니다. 정확히 3 μl를 떠나 뜨는을 제거합니다.
   2. (시퀀싱 키트에서 제공) 시퀀싱 프라이머의 3 μl를 추가, 입자를 재현 탁 아래로 피펫 팅하여 잘 혼합합니다. 2 분 동안 37 ° C에서 다음 2 분 동안 95 ° C에서 품어.
   3. 중합 효소 (제공) 잘 혼합하고 incub의 1 μl를 추가5 분 동안 실온에서 먹었다. 30 분 이내에 시퀀싱 칩 효소 구 혼합물을로드로 이동합니다.
   4. 배양 동안에, 시퀀서 시퀀싱 칩을로드하고 칩의 품질 검사를 수행. 원심 분리에 의해 칩으로부터 액체를 제거하고 천천히 구 효소 믹스 (7 μL)를 누른 pipeting 및 칩 중의 기포의 도입을 피함으로써 칩의 샘플을로드.
   5. 마이크로 원심에서 1 분 동안 칩을 세 번 원심 분리기. 각 원심 분리에서 칩의 방향을 변경하고 피펫 팅에 의해 각 실행 사이에서 아래로 섞는다.
   6. 기기에 칩을 넣고 실행을 시작합니다.

4 기본 시퀀스 데이터 분석

1. 시퀀싱 데이터 서버에 연결하고 fastq 파일을 다운로드합니다. 프라이머와 바코드 정보를 (표 1의 예 참조)이 포함 된 탭으로 구분 된 "올리고"파일을 만듭니다. 경구에서 Greengenes 참조 파일 다운로드허 웹 사이트 ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
2. Mothur를 시작하고 분석을 수행 :
   1. 다음 명령을 사용하여 FASTA에 fastq 파일과 품질의 파일을 변환 : fastq.info (fastq = test.fastq)
   2. 각 시퀀스의 그룹 구성원을 결정하고 다음 명령을 사용하여 시퀀스를 트림 : trim.seqs을 (FASTA = test.fasta, 올리고 = barcode.txt, Qfile을 = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T)
   3. 다양한 옵션을 원하는 엄격도에 따라 변경 될 수있다
   4. 다음 명령을 사용하여 greengenes 분류법의 서열을 분류 : classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, 방법 = 왕, 그룹 = test.groups, 템플릿 = gg_99_otus.fasta, 분류 = gg_99_otus.tax, 차단 = 50)

결과

겔 정제 한 후, PCR 증폭을 25 사이클과 함께, 증폭 산물은 물 50 μL에 겨 0.2-10.0의 농도에서 일반적이다. 이는 출발 DNA 농도, 시료의 종류와 정제 키트에 따라 광범위하게 변할 수있다. 이것은 모든 샘플주기 동일한 번호를 사용하여 증폭한다 명심 키메라 형성을 방지하고 증폭 편견을 줄이기 위해 가능한 최저로 PCR 사이클의 수를 유지하도록 권장한다. 클론의 수를 판독하고, 비어있는 분야를 최소화 그리고 읽기 수를 최대화하기 위해, 큐 비트 비율, 평균 출력은 약 0.1과 0.3 FAM 형광은 이온 런트 PGM에 314 칩을 사용하여 (200) 이상이어야 사이 여야 36 다중화 싸다 함유 실행하기위한 절차의 각 단계 후에 판독 중 0.3-0.5 M 양질 Mothur에서 결과의 필터링 후에 판독한다. 표 2 번호의 전형적인 파괴를 도시정신 시료는 프라이머 16S의 V3-4 영역을 대상으로하고 Mothur를 이용하여 분석하여 증폭. Mothur에서 trim.seqs 절차 품질 필터 및 이유와 함께 품질이 필터를 통과하지 않은 서열을 포함하는 "* .scrap.fasta를"전달 시퀀스를 포함하는 "* .trim.fasta"파일을 생성 시퀀스 헤더의 거부. "올리고"파일에 바코드와 함께 제공되는 경우,이 명령은 또한 바코드 순서에 따라 모든 시퀀스의 그룹 구성원을 포함하는 "* .groups"파일을 생성합니다. classify.seqs 절차는 Excel에서 열 수있는 ".tax.summary"를 생성합니다. 이 파일은 (열)에 각 시료 (라인) 분류학 소속 요약을 포함한다. 이 파일은 하류 통계 분석에 사용할 수있는 다양한 분류 수준에서 커뮤니티 조성물을 시각화. ".taxonomy"파일은 상세한 분류를 포함각 시퀀스에 대한 제휴 나. 모든 샘플 (36)에 걸쳐 분류학상의 문 / 클래스 레벨에서 평균 커뮤니티 조성물은도 1에 도시된다.

모든 샘플에서 분류학상의 문 / 클래스 수준에서 1 평균 공동체 구성을 그림.

앞으로	TACGGRAGGCAGCAG
바코드	CTAAGGTAAC	Sample01
바코드	TAAGGAGAAC	Sample02
바코드	AAGAGGATTC	Sample03
바코드	TACCAAGATC	Sample04
바코드	CAGAAGGAAC	Sample05
바코드	CTGCAAGTTC	Sample06
바코드	TTCGTGATTC	Sample07
바코드	TTCCGATAAC	Sample08
바코드	TGAGCGGAAC	Sample09
바코드	CTGACCGAAC	Sample10

Mothur에서 사용하기위한 실시 예를 표 1 "올리고"파일.

	#의 읽기	이전 단계의 %	평균. 샘플 당
우물의 수	1262519	-	35070
구슬 웰스	1114108	88.20 %	30947
템플릿 비즈	1112746	99.90 %	30910
단일 클론 구슬	826805	74.30 %	22967
좋은 품질 읽기 (시퀀서에서 출력)	782204	94.60 %	21728
패스 Mothur 필터 (분. 평균. 50bp의 창을 통해 20의 품질 평가 점수, 최소. 150bp의 길이)	372168	47.60 %	10338
GreenGenes의 분류학상의 문 수준에서 분류 (50 % 신뢰 한계)	342171	91.90 %	9505
GreenGenes에서 가족 수준에서 분류 (50 % 신뢰 한계)	316512	92.50 %	8792
GreenGenes에 속 레벨에서 분류 된 (50 % 신뢰 한계)	289899	91.60 %	8053

한 이온 토렌트 314 칩에 멀티 플렉스 (36) 환경 시료의 일반적인 실행에서 생성 된 읽기 표 2 수.

토론

여기에 제시된 방법은 간단하고 저렴하며, 많은 실험실 metagenomic 시퀀싱 능력에 액세스 할 수 있도록한다. 이 사용 시퀀싱 플랫폼에 따라 다르지만, 일단 라이브러리는 공정의 대부분이 자동화가되는 매우 작은 손에 시간이 필요합니다 구성된다. 여기서 사용 시퀀싱 플랫폼 (이온 런트 PGM)의 경우, 전체 절차는 작업 이틀 내에서 수행 될 수있다. PCR의 36 샘플의 증폭 : 36 샘플 25달러, 젤 정화 및 PicoGreen DNA 정량은 다음과 같습니다 (2013 년 9 월) 작성하는 순간, 위에서 설명한 예와 관련된 시약 비용이었다 125 달러, 에멀젼 PCR 한 풀링 된 앰플 리콘 샘플 : $ 550 샘플 당 15달러 또는 품질 필터링 읽기 당 $ 0.0015 총 250 달러, $ 150, 시퀀싱 시약. 이 가격은 악기 서비스 계약, 장비 감가 상각, 기술자의 급여 및 실험실 공간 사용을 포함하지 않습니다.

각 시료에 대해 판독의 텐트 "> 가장 중요한 단계 중 하나는 유사한 번호를 검색하기 위해, 등몰 비로 모든 제품을 풀이다. PicoGreen 정량 여기서 사용되었지만, 다른 방법은 비록 덜 정확, 적합 할 수도 (예를 들면, UV 정량, 젤 기반 정량화). 심지어 가장 정확한 정량 및 풀링을 수행하여, 샘플 당 읽기 수에 약간의 변화가있다, 표 2에 설명 된 일반적인 실행, 그것은 4380에서 32750의 범위 10,338의 평균 읽기로 읽습니다. 샘플 (이상 40 ~ 50보다) 많은 수를 처리하는 경우, 단일 열 젤 정화가 엄격한 크기의 컷오프와 함께 접시 또는 정제를 사용하여 비즈 겔 정제로 대체 될 수있다 (예를 들어, AMPure 비즈) .

현재까지, 16S rRNA 유전자에 가장 사용 차세대 시퀀싱 기술은이 프로토콜에서 사용되는 454 이온 런트 시퀀싱 기술은 개념적으로 매우 유사하다이며454과 두 기술은 시퀀싱 에러의 동일한 유형 쉽다. 당연히, 그것은 이온 토렌트 순서가 454 시퀀싱 ^(10)와 매우 유사한 염기 서열 결과를 초래 것으로 나타났다. 최근, 여러 연구자들은 16S rRNA의 유전자 앰플 리콘 서열 ^18,19 일루미나위한 기술의 사용을 탐구 하였다. 어떤 경우에는, 상기 방법으로 최근에 기술 된 것처럼, 이러한 시퀀싱 기술에 필요한 어댑터 및 바코드 맞게 융합 프라이머 서열을 변화시킴으로써 일루미나 MiSeq 또는 454 GS 주니어 등 다른 벤치 탑 시퀀서의 현재 프로토콜을 적응하기 쉬운 것 일루미나 MiSeq ^19. 또한, 연구진은 단계 여기에 설명 된 프로토콜의 1과 2를 따라 에멀젼 PCR 및 시퀀싱을 수행 할 것 시퀀싱 센터로 풀링 증폭 산물을 보낼 수 있습니다.

16S rRNA 유전자는 트리밍 및 Mothur 분류를 사용하지만, 다른 많은 분석이 수행 가능 하였다 읽기16S rRNA 유전자의 증폭 물. 예를 들어, 베타 다양성에 설명 된 절차 사용하여 각 샘플 쌍 사이 Unifrac 거리를 계산하여 평가 될 수 http://unifrac.colorado.edu/ ^20. 다이버 알파 인덱스 및 각 샘플의 분류 학적 연산 유닛의 개수는 ^21처럼 AmpliconNoise QIIME 내에 도구를 사용하거나 Mothur 내의 HUSE 외. ²² 사용할 의해 설명 된 절차를 사용하여 계산 될 수있다.

여기에 사용되는 프라이머는 16S rRNA 유전자로부터 가변 영역들 (3, 4)를 증폭하지만, 많은 다른 영역들이 타겟팅 될 수있다. 본 연구에서, 16S rRNA의 유전자는 식물 재료로부터 증폭 된 프라이머의 선택은 엽록체 16S rRNA 유전자 ^23,24 증폭을 피하기 위해 제출되었다. 제품의 길이, 분류 능력과 유용성 ^{(25), (26)의} 관점에서 차이가 사용할 수있는 다른 프라이머의 다양한있다. 그러나, 모든 경우에 200-400 BP 확실 종 레벨에서 분류 될 수없는 16S rRNA 유전자의 판독 및 분석은 속 높은 분류 학적 수준으로 제한된다. 종 레벨 정보 및 cpn60 rpoB 유전자 ^27,28 같이 필요한 경우에 다른 유전자가 더 적합 할 수있다. 분석 도구의 전력 시퀀싱 및 증가의 비용이 미래의 급격한 하락은 가능 엽총 메타 지노믹스에 의해 16S rRNA 유전자 염기 서열을 대체 할 수 있도록 수도 있지만 그때까지 16S rRNA 유전자 염기 서열은 환경 미생물학의 황금 표준 남아있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion 314 Chip Kit v2	Life Technologies	4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2	Life Technologies	4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit	Life Technologies	4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit	Qiagen	203646
Primers and probes	IDT	NA
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BSA 20 mg/ml	Roche	10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001