Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

Resumen

El transporte axonal de BDNF, un factor neurotrófico, es crítico para la supervivencia y la función de varias poblaciones neuronales. Algunos trastornos degenerativos están marcadas por disrupción de la estructura y la función axonal. Hemos demostrado las técnicas utilizadas para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias.

Resumen

BDNF juega un papel importante en varias facetas de la supervivencia neuronal, la diferenciación, y la función. Déficits estructurales y funcionales en los axones se consideran cada vez más como una característica temprana de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Huntington (HD). Hasta el momento no está claro es el mecanismo (s) por el cual se induce lesión axonal. Se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. BDNF marcado con puntos cuánticos (QD-BDNF) fue producido por la conjugación de punto cuántico 655 a mBtBDNF. Un dispositivo de microfluidos se utilizó para aislar los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. La adición de QD-BDNF al compartimiento axonal permite imágenes en vivo de transporte BDNF en los axones. Hemos demostrado que QD-BDNF movido esencialmente exclusivamente retrógradamente, con muy pocas pausas, a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg. Este sistema se puede utilizar para investigar memecanis- de la función axonal alterada en la EA o HD, así como otros trastornos degenerativos.

Introducción

Las neuronas son células altamente cuyos procesos de largo ya menudo muy elaborado, son fundamentales para el establecimiento y mantenimiento de la estructura y función de los circuitos neuronales polarizados. El axón juega un papel vital en el que transporten cargas desde y hacia las sinapsis. Las proteínas y orgánulos sintetizados en el soma celular necesitan ser transportados a través de los axones para llegar a la terminal presináptica para apoyar la función neuronal. Correspondientemente, señales recibidas en los axones distales necesitan ser transducidas y se transportan a la soma. Estos procesos son esenciales para la supervivencia neuronal, diferenciación y mantenimiento. En que el transporte axonal en algunas neuronas debe llevarse a cabo a través de distancias más de 1000 veces el diámetro del cuerpo celular, la posibilidad se prevé fácilmente que incluso pequeños déficits podrían afectar notablemente la función neuronal y el circuito.

Brain-factor neurotrófico derivado (BDNF), un miembro de la familia de las neurotrofinas de factores de crecimiento, está presente en maregiones del cerebro ny, incluyendo el hipocampo, corteza cerebral, y el cerebro anterior basal. BDNF juega un papel crucial en la formación de la cognición y la memoria mediante el apoyo a la supervivencia, diferenciación y función de las neuronas que participan en circuitos cognitivos. BDNF se une a su receptor, el TrkB tirosina quinasa, en el axón terminal donde activa vías de señalización mediada por TrkB, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógeno / regulada por señal extracelular de la proteína quinasa (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la fosfolipasa C-gamma (PLCγ). Las proteínas que participan en estas vías de señalización están empaquetados en estructuras vesiculares endocítica para formar el BDNF / TrkB señalización endosoma ^1-6 que luego son retrógradamente transportado al soma neuronal.

La cámara de cultivo de microfluidos es una plataforma muy útil para estudiar la biología axonal en condiciones normales, así como en el ajuste de la lesión y la enfermedad ^7,8. Por axones de aislamientoa partir de los cuerpos celulares, el dispositivo ha permitido uno para estudiar el transporte específicamente en los axones ^8-10. Las plataformas de microfluidos PDMS base con 450 micras barreras microsurco utilizados en este estudio fueron adquiridos comercialmente (ver Tabla de Materiales). Para examinar el transporte BDNF, hemos desarrollado una nueva tecnología para producir BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). Aprovechamos el péptido aceptor de biotina, AP (también conocido como AviTag). Es una secuencia de 15 aminoácidos que contiene un residuo de lisina que puede ligarse específicamente a una biotina por la enzima ligasa de biotina coli Escherichia, BirA. Hemos fusionado el AviTag a la C-terminal de la pre-ratón proBDNF ADNc mediante PCR (Figura 1A). La construcción se clonó en el vector de expresión de mamífero, pcDNA3.1-myc su vector. También clonado el ADN bacteriana BirA en el pcDNA3.1-myc su vector. Los dos plásmidos se co-transfectaron transitoriamente en células HEK293FT para expresar ambas proteínas. BirA catalizó la ligadura de Bioten concreto a la lisina residen dentro del AviTag en el C-terminal de BDNF en una proporción de 1: 1 para producir monómero monobiotinylated BDNF. Biotinilado, BDNF maduro con una masa molecular de ~ 18 kDa fue recuperado y purificado a partir de los medios de comunicación utilizando resina de Ni-(Figura 1C). La biotinilación de BDNF era completa, como se juzga por la incapacidad de detectar sin modificar BDNF por inmunotransferencia (Figura 1D). Puntos cuánticos conjugados con estreptavidina, QD 655, se utilizan para etiquetar mBtBDNF hacer QD-BDNF. La presencia de la AviTag no interfiera con la actividad del BDNF como la mBtBDNF fue capaz de activar TrkB fosforilado (Figura 1E) y estimular el crecimiento de neuritas (Figura 1F) en la medida de BDNF humano recombinante (rhBDNF). Inmunotinción demostró que QD-BDNF colocalized con TrkB en los axones del hipocampo, lo que indica que QD-BDNF es bioactivo (Figura 1G). Para estudiar el transporte BDNF, QD-BDNF fue añadido al compartimento de axón distalculturas de microfluidos que contienen rata E18 neuronas del hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de los axones fue capturado por el tiempo real de imágenes en vivo de la etiqueta fluorescente de color rojo (con soporte para vídeos S1, S2). Mediante el análisis de la quimógrafo generado, QD-BDNF se observó para ser transportado retrógradamente a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg (Figura 3A). GFP o marcado con mCherry BDNF se han utilizado para seguir el movimiento axonal de BDNF. Los principales inconvenientes son que no son lo suficientemente brillantes para los estudios de una sola molécula. Además, la presencia de tanto anterógrada y retrógrada movimientos de BDNF hace que sea difícil evaluar si o no el BDNF retrógradamente transportado estaba en un complejo neurotrofina / receptor.

En este video, nos demuestran las técnicas que se utilizan para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias. El ultrabrightness y excelente fotoestabilidad de los puntos cuánticos MAKes posible realizar el seguimiento a largo plazo del transporte BDNF. Estas técnicas pueden ser explotados para mejorar estudios de la función axonal en AD, HD, y otros trastornos neurodegenerativos.

Protocolo

Los procedimientos quirúrgicos y animales se llevan a cabo estrictamente de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los experimentos que implican el uso de animales son aprobados por UCSD Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. plásmido de clonación, expresión y purificación de biotina-Mono BDNF (mBtBDNF)

NOTA: Construir pre-proBDNFavi y cDNA BirA en el vector pcDNA3.1 y coexpresan en células HEK293FT ^10. Purificar mBtBDNF utilizando perlas de Ni-NTA según el método publicado previamente de la producción de factor de crecimiento nervioso monobiotinylated madura y biológicamente activa (mBtNGF) ^10.

2 Preparación de microfluidos Cámaras

Dispositivo de cultivo de neuronas de microfluidos hace que sea posible para aislar de manera fluida los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. Montar cámaras con cubreobjetos recubiertos recién justo antes de cada disección. Cámaras de microfluidos utilizadosen este protocolo se compran en el mercado (ver materiales y la mesa del equipo). Lavado a mano y reutilizados cámaras adquiridos comercialmente hasta 5-6 veces.

1. Lavar a mano cámaras de microfluidos en 1% Alconox. Enjuague tres veces con agua Milli-Q durante 30 min cada uno. Cámaras de lavado a mano de nuevo en etanol al 70%.
2. Coloque cámaras a secar en Parafilm en la campana de flujo laminar. Irradiar y esterilizar ambos lados de las cámaras durante 20 min bajo UV. Tienda esterilizado en un recipiente estéril cámaras 15 cm plato de sellado con Parafilm a temperatura ambiente.
3. Coloque 24 x 40 mm N º 1 cubreobjetos de vidrio en un recipiente de vidrio. Remojar los cubreobjetos en ácido clorhídrico al 35% durante la noche en un rotador. Al día siguiente, enjuagar los cubreobjetos tres veces durante 30 minutos cada uno con agua.
4. Esterilizar los cubreobjetos uno a uno por inmersión cada cubreobjetos en etanol al 100% y en llamas sobre un mechero Bunsen. Guarde cubreobjetos secos en una placa de Petri estéril y mantenerlo a temperatura ambiente hasta recubrimiento.
5. Coloque out los cubreobjetos en una placa de cultivo de 15 cm. Escudo cada cubreobjetos con 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) y se incuba en la campana a temperatura ambiente.
6. Después de 1 hora, enjuague los cubreobjetos tres veces con agua estéril. Cubreobjetos secos con vacío y el lugar cada cubreobjetos en una placa de cultivo de 6 cm.
7. Para montar la cámara de microfluidos, coloque la cámara con el lado microsurco en la parte inferior en el cubreobjetos recubiertos PLL con precaución de no tocar los microsurcos. Presionado suavemente la cámara con una punta de pipeta para asegurar la cámara se cerró herméticamente.

3. Disección de cultivos neuronales y Placa en Cámaras

1. Coloque dos hipocampos E17-E18 de rata (un cerebro) disecados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de tampón de disección (HBSS, sin calcio, magnesio no, con 1% penicilina / estreptomicina y HEPES 10 mM. Enjuagar los tejidos 3 veces con 5 ml disección tampón cada vez. eliminar el tampón de disección tanto como sea posible y añadir 900 l de di frescatampón ssection.
2. Para digerir el tejido, se añaden 100 l de 10x tripsina (2,5%) en el tampón de disección para hacer concentración de trabajo 1x. Coloque el tubo cónico en un baño a 37 ° C. Después de 10 min de la digestión, añadir 100 l de 10 mg / ml de DNasa I a una concentración final de alrededor de 1 mg / ml.
3. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego, se tritura suavemente los tejidos pipeteando arriba y abajo 5-10x. Justo después de la trituración, se extingue la tripsina con 2 ml chapado medio (Neurobasal con 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27).
4. Deja la muestra en la campana durante 5 minutos para permitir que todos los residuos de los tejidos para establecerse en la parte inferior. Retire cuidadosamente 2 ml de sobrenadante en un tubo limpio y estéril 15 ml cónico y centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células. Resuspender el precipitado en 50 l chapado medios
5. Contar las células con un hemocitómetro. Load 15-20 l de suspensión de células (~ 40.000 células) en un compartimiento de la cámara de microfluidos. Coloque la cámaraen la incubadora durante 10 minutos para permitir que las células se unan a la cubreobjetos. Después de 10 minutos, agregue los medios más chapado a llenar los dos compartimentos de la cámara.
6. En el segundo día de la disección, reemplazar completamente los medios de comunicación de placas con medio de mantenimiento (Neurobasal con 2 mM de GlutaMax, 2% B27) tanto en el cuerpo de la célula y el compartimento del axón. Los axones de las neuronas del hipocampo empiezan a cruzar los microsurcos en el día 3 y alcanzar el compartimiento axón entre los días 5-7. Durante este período de tiempo, reemplace la mitad de los medios de cultivo con medio de mantenimiento fresco cada 24 ~ 48 hr.

4. Axonal Transporte de QD-BDNF

1. Antes de imagen en directo de QD-BDNF transporte axonal, agotar BDNF tanto desde el cuerpo celular y el axón compartimentos de la cámara de microfluidos por enjuague a fondo ambos compartimentos con BDNF-libres, suero libre de los medios de comunicación Neurobasal cada 30 min durante 2 horas.
2. Durante el agotamiento de BDNF, preparar los conjugados QD-BDNF. Mezclar 50 nM de mono-biotina BDDímero NF con 50 nM conjugados de estreptavidina-QD655 en medios Neurobasal e incubar en hielo durante 60 min.
3. Retire el medio en el compartimiento de axón y añadir 300 l QD-BDNF con una concentración final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar el difusora de QD-BDNF en el compartimento de cuerpo celular, es muy importante mantener siempre un nivel más alto de los medios en el compartimiento de cuerpo de la célula que en el compartimiento de axón. Lavar sin unir QD-BDNF después de la incubación antes de imágenes en directo.
4. Llevar a cabo formación de imágenes en vivo de transporte QD-BDNF usando un microscopio invertido equipado con un aceite lente objetivo 100X. Calentar el alcance y la cámara ambiental que se le atribuye a una temperatura constante (37 ° C) y CO ₂ (5%). Utilice un conjunto de cubos de Texas excitación rojo / emisión de visualizar la señal QD655.
5. Adquirir y capturar imágenes con lapso de tiempo dentro de los axones media a la velocidad de 1 fotograma / seg para un total de 2 min usando una cámara CCD. Use microsurcos sin axones that no tienen QD y por lo tanto no hay señal como un control para la infiltración.
6. Analizar transporte BDNF usando cualquier software de análisis de imagen o NIH ImageJ.

Resultados

Producción y purificación de biológicamente activos BDNF Mono-biotina

El vector de expresión de BDNF fusionado con una secuencia de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fue creado de acuerdo con un protocolo previamente publicado ^10. La masa molecular de la proteína de fusión de longitud completa se predijo a ser ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) fue producido Monobiotinylated BDNF maduro con una ...

Discusión

En este estudio, se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activa, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. Por la conjugación de la proteína a la estreptavidina punto cuántico, y el uso de una cámara de microfluidos, el método permite una para detectar el transporte axonal de BDNF en las neuronas primarias con sensibilidad única molécula, en tiempo real y con las resoluciones espaciales y temporales. Las herramientas uti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
d-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
silver staining kit	G-Biosciences	786-30
human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24x40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101