聴覚神経の光遺伝学的刺激

要約

人工内耳（CIの）聴神経を直接電気刺激によって聴力ができます。しかし、貧しい頻度と強度分解能はCIので聴力の質を制限します。ここでは、聴覚の研究と今後のCIを開発するための代替戦略として、マウスにおいて聴覚神経の光遺伝学的刺激を説明します。

要約

人工内耳によるらせん神経節ニューロン（SGNS）の直接電気刺激（CIS）は、移植された聴覚障害の被験者^1〜6の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にします。それにもかかわらず、現在のCIとの健全なコーディングが原因蝸牛^{7 9}のtonotopic軸に沿ってSGNSの多数を作動させる各電極接点から幅広い現在の普及に貧しい頻度と強度分解能を有する。光刺激は、したがってSGNSと、空間的により閉じ込められた活性化、符号化のより高い周波数分解能を約束する電気刺激の代替として提案されている。近年では、蝸牛の直接の赤外線照明は聴神経¹⁰における応答を誘発するために用いられてきた。それにもかかわらず、電気刺激^10,11と不確実性は、基礎となる機構¹²のように残っているよりも高いエネルギーを必要とします。ここでは、SGNSを刺激するためにoptogeneticsに基づく方法を記載している低強度の青色光と、ChR2を変キャッチ¹⁴のチャネルロドプシン2（ChR2を^）13またはウイルス媒介発現が神経細胞の発現とトランスジェニックマウスを用いて。私たちは、小さな人工開口部（蝸牛）または丸い窓からChR2を発現SGNSを刺激するために、マイクロ発光ダイオード（μLEDs）とファイバ結合レーザを使用。聴覚路または微小電極記録によって音響および電気刺激と比較した：私たちは、光誘発電位（oABR光遺伝学的聴性脳幹反応）の頭皮記録によって反応を分析した。

概要

世界保健機関（WHO）によると360万人が世界中で難聴に悩まされている。聴覚障害の被験者では、CIのよるSGNSの直接電気刺激はそれら^1,2,4,5の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にする。 CIは、したがって最も成功しneuroprosthesisいる、20万人以上の人に移植されているにもかかわらず、現在の蝸牛インプラントによって駆動音エンコードが限られている。 CIは、各1は、このように蝸牛内コルチ機能不全感覚器官を迂回する聴覚神経のtonotopic地域を活性化し、電極の特定の数によって電気刺激に基づいています。通常の聴力リスナーが2,000以上の周波数を識別することができる、しかし、今日のCIのは、12〜22の周波数チャネル⁴まで使用しています。これは^8,15、多くの異なるサウンド周波数を表すSGNSの多数を作動させる、各刺激電極^7,9から広まっ電流の流れに起因している。この制限は、多極刺激を使用して、より高い電力消費^16,17を犠牲にして改善することができる。音の強さのための彼らの出力ダイナミック·レンジは、通常、dBで^4,18 6-20の下にも制限されています。これらの理由から、頻度および強度の解像度を向上させることは、ノイズの多い環境、韻律理解や音楽の知覚に音声認識を改善するためにCI性能を高めるための重要な目的である。

聴覚神経を刺激する別のオプションは、光刺激である。光は、好都合には、良好な空間閉じ込め有望な周波数分解能を増加させ、より良い強度分解能で、その結果、ダイナミックレンジを広げる、SGN小集団を標的とするように集束させることができる。実際には、赤外光による蝸牛刺激は、動物モデル^10,11,19に優れた周波数分解能を示している。刺激のこの種の1つの欠点は、電気刺激よりも高いエネルギーを必要とすることで ^{10,11。また、直接聴覚神経細胞を刺激する方法の能力についての懸念が12,20が提起されている。}

赤外線刺激の代わりに、私たちはSGNS光感受性レンダリングするoptogeneticsを採用している。 Optogeneticsは、非侵襲的に遺伝的および光学技術を組み合わせて、具体的には、高い時間精度（レビュー^21〜23）で細胞を制御する新規のアプローチである。現在最も頻繁に使用される様式は、 クラミドモナスの微生物チャネルロドプシン-2（ChR2を）遺伝子の発現を採用し、光依存性カチオンチャネル^24をコードするその変異体である。 ChR2を、ニューロンに形質導入し、青色光によって活性化されると、このように細胞の^{24 27を}脱分極、非選択的陽イオンチャネルとして機能し、7回膜貫通ヘリックスタンパク質である。 ChR2を、よく特徴付けられている^{24,28- 31}と多くの変異体は、アクティオを変更するために開発されているn個のスペクトル、ゲーティングと透磁率の特性^32,33。私たちの仕事の目的は、聴覚経路の活性化のための蝸牛optogeneticsを確立することである。私たちは、聴覚神経を刺激する光遺伝学的アプローチは、チャネルロドプシンを発現させるためのスパイラル神経節の遺伝子操作を必要とすることに注意してください。マウスおよびラットの操作tonotopic軸に沿っや動物³⁶のところが少し変動してチャネルロドプシンの発現を提供利用可能なトランスジェニック動物^13,34,35、の使用を可能にする。適切なのCre-ラインとの条件付き対立遺伝子^37を組み合わせることにより、細胞特異的発現を提供する。他の動物の螺旋神経節への遺伝子導入は、そのようなoptogenetics ³⁸に標準的なアプローチであると私たちはマウス³⁶でうまく動作することを示したアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを使用する必要があります。外国人のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子操作および発現は、IMMUなどの副作用のリスクを負担するNE応答および/または増殖、妥協の条件または遺伝的に操作された細胞の死。このデモの目的のために、私たちは、光学的、聴覚経路を刺激するのThy-1プロモーター^13歳未満のらせん神経節ニューロンにおいてChR2を発現するトランスジェニックマウスを使用しています。私たちは、SGNS ³⁹に変異体キャッチ¹⁴のウイルス媒介転移を用いて実証されるように、他のチャネルロドプシン変異体は、同じ目的に使用することができることに留意されたい。

蝸牛optogeneticsは、遺伝子操作を必要とするが、それは最適化されたSGN刺激と電気刺激と比較すると、周波数や強度分解能を向上させ、約束のための分子チューニングを提供しています。聴覚路の光遺伝学的刺激が研究を聞くために非常に関連しています。たとえば、音のスペクトルの統合のための要件の分析に、開発中のtonotopyの活性依存洗練の研究の進歩を約束localizatイオンおよび中枢聴覚システムにおける周波数固有の求心性突起間の相互作用の程度。

プロトコル

この作品で提示全ての実験は、実験動物の保護のためにドイツの法律で定義された倫理基準を用いて行った。動物福祉のための大学ゲッティンゲンのボードとニーダーザクセン州の状態の動物福祉事務所は実験を承認した。

μLED-刺激剤の調製

1. μLEDs、最初μLED-刺激装置を準備します。 200μmの活性表面200と青色LEDを使用してください（μLED、材料表を参照のこと）。
2. μLEDへのはんだワイヤー。その後、μLEDとエポキシ接着剤を使用して接続をカプセル化します。エポキシ硬化をできるように、デバイスを一晩にしておきます。
3. 機械的安定性及び電気的絶縁のために、薄いガラスキャピラリーを通してワイヤを漏斗1ミリメートル、外径のホウケイ酸の毛細管を使用し、エポキシ（ 図1D）との接合部を密封するキャピラリー機械的マニピュレーターに取り付けることができるようになっている。
   注：Tここでは（刺激アーチファクトを回避する）良好な電気的絶縁を得るために十分な厚さのカプセルを作る、トレードオフがありますが、十分薄いLEDはブラの中に自由に移動できるようにし、蝸牛にそれを見つけること。これは、複数のLEDを用意することをお勧めします。
4. 良好な電気的絶縁を確認するには、最初の液体中に、0.9％NaClおよびディップ3裸終了銅線とペトリ皿を準備します。これは、ABR電極を有する動物をシミュレートするのに役立つ。 ABR-アンプに、そこからオシロスコープへの配線を接続します。
5. その後、刺激装置にLEDを接続し、それが完全に覆われるまで溶液中にそれを浸す。 20分以上のための現在の許容される最大で（ステップ3.1.1を参照）パルスでLEDを駆動し、刺激アーティファクトを確認してください。彼らが表示される場合は、LEDを破棄し、新しいものを試してみてください。

2外科的手技

1. Thy1.2プロモーター下にChR2を発現している4-10週齢のトランスジェニックマウス（9行を使用してください）Wang ら ^13。動物を操作し、手術を行うためには、常に清潔で特定された手術器具を使用しています。
2. ウレタン（1.32ミリグラム/ kg）を、キシラジン（5mg / kgの）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔し、ブプレノルフィンは0.1μg/ gで、0.9％滅菌NaCl溶液中に希釈し、身体を維持するための加熱プレートの上にマウスを置き37℃での温度。この用量では、全身麻酔は、通常、全体の実験プロトコル持続します。
   1. 足引っ込め反射による覚醒の兆候が最初の麻酔導入確認後の10分の開始。動きの場合には、（キシラジンなし）0.9％滅菌NaCl溶液で希釈したウレタン（0.66ミリグラム/ kg）およびブプレノルフィン（0.05μgの/ g）での維持用量を適用する。ここでも足引っ込め反射をチェックして、反射が存在しない場合にのみ進みます。
3. 慎重に切開の製造における耳介の領域を剃る。耳介を使用してください水疱（空気含有中耳腔）に到達するためのアプローチ。
   1. マイクロピンセットで慎重に解剖および/ ​​または首の筋肉の一部を除去、 たとえば、広頸筋、胸鎖乳突筋、およびscalenes。
   2. 検索と水疱（ 図1A）を露出。鼓膜（ 図1A）の挿入を示しているブラ表面上のリングを有する特徴的な球状の形状を有する骨構造としてブラを識別します。ちょうどこのリング下のインスリン針の先端の穴を作る。蝸牛の岬角（ 図1B）が露出されるように、細かい骨鉗子（齧歯動物）またはマイクロピンセットで水疱を覆っている骨を取り除く、そこに開始します。
4. 無傷の膜迷路（ 図1B）を残すように注意しながら、：蝸牛のために、静かに小さなウィンドウを開きます（〜500〜800ミクロン蝸牛）を骨のカプセルを剃り落とす。第二蝸牛に蝸牛を実行しますそれはあぶみ骨動脈からと頂点から十分離れているようにしてください。頂点を開くと、蝸牛軸の破断などの蝸牛の破裂を作り出すことができる。
5. 鼓室階への光ファイバやμLEDインプラントの丸窓の挿入のため、慎重に鋭利な外科用メス（ブレード番号11は良いオプションです）の先で骨のニッチを引っ掻くことで丸い窓の隙間を拡大する。常に新しいブレードまたは外科用メスを使用しています。あぶみ骨動脈が丸いウィンドウ（ 図1B）に非常に近い動作するように十分注意してください。

2つのアプローチを使用して3。光刺激

1. transcochlearの刺激のために、μLEDsやファイバ結合レーザを使用しています。
   1. 機械式マニピュレータ上μLEDを運ぶ毛細血管をマウントし、慎重に蝸牛にμLEDを配置。利用oABR、位置を最適化するための手段として、1〜5 Hzの電流源（2.7 Vで、通常、5〜40ミリアンペア）から3-10ミリ秒の長い刺激によって誘発されると、またはμLEDのientation。
   2. レーザー刺激のために、473nmの連続波レーザと250μmの光ファイバ（材料を参照）を使用しています。カップルが理想的（光学的刺激を定義するために音響光学素子や高速シャッターを使用する他の）電力の高速なアナログ制御を提供しています青色レーザ光源と光ファイバ。マイクロマニピュレーターを使用して、蝸牛に直接ファイバの先端を見つけ、歯科用セメント（transcochlear刺激）を使用して、そこにそれを修正。
2. 蝸牛内刺激のために、鼓室階の丸窓からファイバーを挿入します。その後oABRを引き出すために1-5 Hzで10〜30 mWの（ファイバ出力のパワー）の3-10ミリ秒のレーザーパルスを使用しています。 oABRの大きな振幅は、読み出しとしてoABR振幅を用いて、エミッタ（μLEDまたはファイバ）の位置と方向を最適化するために、オシロスコープ上で単一の刺激により惹起さoABRを観察する実験を可能にします。
3. 良いoABRが達成されたら、cyanoacrを有する繊維を修正ラート接着剤又は歯科用セメントや接着剤が固体になるまで待ちます。
   注：それは、蝸牛から出てくるいくつかの液体を観察するようにするのが普通です。しかし、セメントの重合に伴う問題を回避するためには、上質なコットン芯を使用してリージョンを枯渇することをお勧めします。

oABR 4。録音

1. 頂点に、足に近い背中に、耳介の下に針電極を挿入し、アンプに接続します。
2. 頂点間の差電位を増幅し、皮下注射針を乳様突起。 50 kHzとフィルター（1〜10,000ヘルツ）の速度でサンプリングする。光刺激装置の位置を最適化するための理想的記録セットアップ近いオシロスコープの差電位を可視化。信号平均（50-1,000x）を使用してオフライン解析用コンピュータ上のデータを格納します。

光学的に誘発ローカル電場電位の5。録音

1. 定位フレームに動物を配置します。鉗子セントの使い方ラリーは、頭蓋を覆う皮膚を引っ張るとハサミは大きく首の筋肉は頭蓋骨に付着する点に目の間から延びる正中切開を行う。
   1. 横方向に皮膚を反映している。矢状縫合に沿って縦に骨膜を切り、静かに綿棒で露光頭蓋骨を擦ってそれを側方を削除します。
2. プレートとラムダの尾側端部との間に約1mmのスペースを残しさらさ頭蓋骨上にカスタムメイドの金属板を配置します。直径0.7mmのドリルで慎重に頭頂骨に穴を開けます。
3. 静かに0.85ミリメートルの直径のネジでネジ - 下丘（IC）から記録された電位の基準となるために - などの長いネジがしっかり固定されていないようにピンセットでネジを保持している。脳を貫通することなくネジと硬膜との間の良好な接触を確認してください。シアノアクリレート接着剤で頭蓋骨にネジと金属板を接着。
4. n個をゆるめ静かに頭蓋骨からECKの筋肉。 1-2年頃mmのための尾側に首の筋肉を引き出します。上矢状静脈洞（SSS）および横洞（TS）との交点を特定します。必要であれば、生理的NaCl溶液で骨を加湿することによって頭蓋骨の透明性を高める。
   1. SSSとTS交差点に直接尾にあるとマウスでは、ICを特定します。 ICの位置を同定した後、ゆっくりと慎重にCAを拡張する穿孔を行う吻方TSと横方向に約3 mmまで尾側1.5ミリメートルに0.5ミリメートル。
   2. これらが成功した実験を妨げるとして、SSSおよびTSへの傷害を避ける。ここでは、トレパネーション骨が柔らかく、それを押すことで緩んなってきたかどうかをテストします。鉗子を使用すると、ゆっくりと骨から持ち上げます。
5. 適切なアダプタでマイクロマニピュレータ上に多チャンネルアレイとヘッドステージを添付してください。 ICへの挿入時にマルチチャンネル記録配列を破壊しないようにするには、慎重に硬膜を削除小さな皮下注射針の屈曲先端が骨の端の近くに開始した。
   1. 定位フレームから動物を削除します。定位固定のままにバーの上に金属板を固定します。 ICの上に記録プローブを置き、一番上のチャンネルが表面でちょうど見えるように微細な制御下に挿入します。
6. オフライン分析のためにコンピュータ上で32kHzのローパスフィルタ（300 Hz）の店舗の速度で記録·アレイと頭頂骨における基準スクリュー、サンプルの各チャンネル間の差電位を増幅する。
7. 全ての動物は人道的に先立って、関連する安楽死ガイドラインに従い、麻酔回復手順の最後に安楽死させなければならない。安楽死の適切な方法は頸椎脱臼またはCO ₂吸入を含むことができる。

結果

最適蝸牛は重要であり、成功した実験の可能性が高くなります。これはウィンドウは、定期的に小さく、内部蝸牛構造の全く怪我がないことを意味します。例えば、出血は血管条の破損を示している。良い例は、 図1Bに示されている。

ChR2をトランスジェニックマウスを用いて、ChR2を蝸牛（ 図1C）内のSGNSで発現される。青色光?...

ディスカッション

記載された実験は、SGNSの光遺伝学的刺激を実証し、そして、原則的に、また内側及び/又は外側有毛細胞を刺激するために使用することができ、オプシンの発現を提供した。これらの実験は、多くの忍耐と注意が必要です。前述のように、最も重要なステップは、光源の良好な蝸牛/正円窓挿入ならびに適切な位置および向きである。

ChR2をを使用して、光遺伝学的刺激に...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe