導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

要約

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

要約

ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）は、レンチウイルスベースの再プログラミング方法論を用いて生成することができる。しかし、ゲノムの積極的に転写領域内に残っている可能性の発癌性遺伝子の痕跡は、人間の治療への応用¹で使用するための彼らの可能性を制限する。さらに、治療に関連する誘導体に幹細胞のリプログラミングまたは分化由来の非ヒト抗原は、ヒト臨床状況²において使用されるこれらのhiPSCsを排除する。このビデオでは、外因性の導入遺伝子の自由要因フリーhiPSCsを再プログラムし、分析するための手順を提示する。これらhiPSCsその後、レンチウイルスを含む特定のイントロンにおける遺伝子発現異常を分析することができる。この分析は、以前に³遺伝子発現の差を検出するために使用されるあまり敏感技術に勝る利点を有する敏感な定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて行ってもよい。への完全な変換臨床グレードの適正製造基準（GMP）の条件は、ヒトの臨床関連性を可能にする。私たちのプロトコルは、別の方法論が提供する現在のセーフハーバー基準による非ヒト抗原にすべての免疫原性リスクを排除する必要があり、人間の治療用途-ためのGMPグレードのhiPSCsを導出するための要因の無特徴付けられたhiPSC系誘導体を、拡張し、含まれることを提供しています。このプロトコルは、任意のタイプのレンチウイルス再プログラミングされた細胞に広く適用可能であり、GMPグレードの条件に再プログラミングされた細胞を変換するための再現性のある方法を提供します。

概要

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors^4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression⁶. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process⁷. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived⁸. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions.

Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction^3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics⁹. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions¹⁰. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance.

These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics¹¹.

We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions¹⁰. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

プロトコル

注：この方法は、内素晴らしいら ^10の報告された研究に使用した。

STEMCCA 1.リプログラミング成人ヒト皮膚線維芽細胞

1. 解凍成人の皮膚、ヒト線維芽細胞（HUFs）、2分間37℃の水浴中で継代4以下、水とバイアルの上部水没しないように注意しながら。
2. 15mlのコニカルバイアルにヒト線維芽細胞を1mlのスラリーを置き、ゆっくりとジメチルスルホキシド（DMSO）のうち希釈するために、滴下様式で、37℃に予め温めておいた標準HUF培地4mlのを配置し再懸濁細胞。
3. 遠心分離を室温で10分間、200×gでバイアル。上清を吸引し、及び/ mlの100,000細胞の懸濁液を作成するために、メディアの適切な容積中で細胞を再懸濁した後、6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットルを追加、0.2％ゼラチンで20分間プレコーティングされた。
   注：行当たりのセルの数と同じ数とよく妹と条件がFOを播種する必要があります感染の細胞計数/多重度（MOI）の計算をrを。
4. 左右すると前後に細胞を均一に分配するプレート側を揺する。加湿インキュベーター中、37℃、5％CO ₂で一晩インキュベートする。
5. 形質導入の日に、最初のHUFめっき後ウェル（単数または複数）の姉妹から約24時間後に細胞数（s）を得る。
6. 2×10 ⁸ TU、または同等の、レンチウイルス濃縮物（STEMCCA）を行う解凍し、HUF培地で1×10 ⁸ TU / mlに希釈する。
7. 8 / mlのトランスフェクション剤を補充HUF培地中で、10 MOI比で細胞に形質導入​​する。均等に形質導入されたウェルを混合し、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO ₂で一晩インキュベートする。
8. レンチウイルス形質導入後の約24時間後には、標準のヒト多能性幹細胞（PSC）を培地にHUFメディアを切り替える。
9. 日2〜6日、人間のPSC培地で毎日のメディアを変更。
10. 6日目に、プレートの2 0.2％ゼラチンでコーティングされた10cmのプレートHUF媒体¹²においてCF1マウス由来の1.5×10 ^6〜1.75のMEF。
11. 7日目に、注意して、均等にすべてのセルをめっきすることによって、1時16分比率で6ウェルプレート及び通路の1つのウェルから7日目に再プログラミング線維芽細胞をリフトオフする100以上のXG、利用室温トリプシンを遠心分離機にしないMEFの前日に播種した新鮮なヒトPSC培地を有する2つの10cmプレート、。 37°Cで時計回りに螺旋運動と場所で細胞凝集物を分散、5％CO _2で一晩インキュベータに加湿。
12. 約48時間後以降のMEFと毎日に再プログラムされた細胞を播種した後、新鮮な培地と一緒に過ごした人間PSCメディアを変更します。
13. 0.2％ゼラチンでコーティングした、個々のウェルの中に特定のコロニーの約8~10個片を配置することにより、3〜4週間後、21ゲージ針で形態のように、典型的なESCとの個々のコロニーをピックアップし、24ウェルプレートに出てサブクローニング24ウェルプレートプレシード人間PSC培地中のCF1マウス由来のMEFとED。
    注：採取したコロニーの増殖後、コロニーをタンパク質レベルでの胚様体形成及び多能性マーカーの発現解析によって、多能性として特徴づけされなければならない。

2.ベクトル統合サイト分析とSTEMCCA切除

1. ^10に記載されるように、非限定的な線形増幅PCRによってSTEMCCA組込み部位を分析する。
2. 古い人間のESC培地を吸引除去することにより、ゲノム、物品税STEMCCAの所望の領域に1の統合を確実にするためにアッセイすることの後。その後、24時間、標準PSCメディアの3ミリリットルで8 / mlのトランスフェクション剤と濃厚アデノのCre-PuroRウイルスの45μLを兼ね備えています。
3. 24時間のインキュベーション期間の後、混合ウイルス上清を吸引し、ヒトPSC培地で細胞を2回洗浄する。メディア毎日のウィットを変更し、5日間、2μg/ mlのピ​​ューロと一緒に新鮮なヒトPSCメディアを配置H新鮮な培地と抗生物質。
4. 5日後、0.2％ゼラチンでコーティングされたウェル上に21ゲージの針を有するコロニーを、残りのサブクローンは、12ウェルプレートにCF1miceから派生したMEFで予めコーティングし、上記で詳述したように膨張する。
   注：凍結ストックを得るために十分な拡張した後、無フィーダー条件への変換が必要です。ほとんどの細胞が正常に形質導入​​されず、インキュベーションの5日間にわたって抗生物質に屈するように少なくとも95％の幹細胞コロニー死を期待する。アデノのCre PuroR因子を含まないコロニーのサンプルをreexposing、感染細胞の宿主染色体への0.001から1パーセントの効率で統合しているがない統合が^13を発生していない確認する100％の細胞死を確実にするためにピューロする。
5. マトリックスが液体になるまで約2時間（製造業者の推奨）の期間にわたって、氷上でプレ等分基底膜マトリックス1バイアルを解凍し、冷基本培地中で1：30の最終濃度に希釈するアウト。共同ウェルあたり1mlで6ウェルプレート中のウェルの所望の数で。 1時間室温で放置します。
6. （18ゲージの針を使用して、またはガラスもしくはプラスチック製の「先端」）は、クロスハッチ、少なくとも20〜30個のコロニーよく以前のMEFで被覆されたから。プレートからMEFの高揚と伝達を低減するように注意してください。
   1. 滅菌プラスチックピペットチップの簡単な使用のために、火に、より複雑な加熱から、多数の異なるアプローチを介してガラスパスツールピペットの引っ張り、及び仕上げクロスハッチングデバイスを生成するか、私たちの場合のように、 21-および/または18-ゲージの針。
7. インキュベーション後にコーティングされたウェルから行列を吸引除去する。
8. 200μlのピペッターで古いプレートから穏やか掻きによってコロニーの部分を削除し、慎重にマトリックスでコーティングされたプレートで新鮮な複合メディア1の3ミリリットルに入れる。 37℃、5％CO ₂加湿インキュベーター中で一晩インキュベートする。変化媒体48時間継代後に。
9. 市販のDNA抽出キットを使用して、80％以上の密集度で、ポスト切り出し、無フィーダー変換されたhiPSCsからゲノムDNAを抽出します。
10. STEMCCAのレンチウイルスの外因性の統合のための特異的なプライマーとの適切な切除のために分析します。gDNAを-hendo-MycSフォワード、5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNAを-hWPREリバース、5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '。 10μmの原液にPCRグレードの水を用いて凍結乾燥したプライマーを再構成する。
11. 以下の5段階のプロトコルを用いてPCRを実行し、3分間95℃での初期変性;以下の各35サイクル：20秒間98℃での変性、15秒間62℃でのプライマーアニーリング、及び15秒間72℃での伸長。 3分間の72℃での単一サイクルの最終伸長が続く。
12. アガロース1.5グラムを秤量し、50mlの1×トリス - 酢酸-EDTA緩衝液中に配置することによって、3％アガロースゲルを作る。アガロースまで、電子レンジを溶解し、PでのDNAゲル染色に配置されているローパー希釈、混合し、室温で1時間凝固させ、ゲルカセットに適切な容積を分配する。
13. PCR産物の負荷12μlを3％アガロースゲルにローディング色素を3μlと混合した。 80 Vで30分間ゲルを実行する
14. 適切な切除を示すバンドがないことを紫外光を可視化する。

前後の切除したhiPSCsから定量的PCRを用いた遺伝子発現差の3定量

1. 商業RNA抽出用キットを用いて、ポスト切り出し、無フィーダー変換されたhiPSCsから全RNAを抽出します。
2. 逆転写製造業者の説明書に従って市販のキットを用いて全RNAを1μgまで。アンカーオリゴ_（dT）18及びランダムヘキサマープライマーを使用してください。
   注：PCRプロトコルは4 KBよりもより多かれ少なかれの遺伝子転写物に合わせて調整されていることを確認してください。特異的プライマーは、いずれかの遺伝子STEMCCAもともと統合Iのために作られる必要がありますNtoを。
3. 20μMストック溶液をPCRグレードの水で凍結乾燥されたプライマーを再構成する。
4. フォワード10μMのUPLプローブ、2Xライトサイクラー480プローブマスター、および20μMで構成され、プライマーを逆反応を20μlあたりのサンプルの5 ngのを使用してください。

GMPグレードの条件に4.コンバージョン

1. GMPグレードの条件にフェイルオーバ後に切除hiPSCsを移行するの初日には、合わせて人間のPSCからなるメディアのブレンドを作るメディア1（複合メディア1）、臨床グレード適正製造基準（GMP）に準拠したメディア（複合メディア2 ）80:20の割合で。
2. 吸引物古い複合メディア1とを80:20の比率で新しい複合メディア1及び2、予め温めた3mlのを配置オフ。この特定の比率で3日間、毎日メディアを変更します。バック37℃、5％CO ₂インキュベーター中に置き細胞。
3. 4日目に、50：50の割合で混合メディア1と2を作る。古い培地とREPLACオフ吸引除去50:50の比率で複合メディア1及び2を予め温めたメディアと電子。この特定の比は3日間のメディアを変更します。バック37℃、5％CO ₂インキュベーター中に置き細胞。
4. 7日目に、20：80の比率で組み合わせたメディア1と2を作る。吸引除去古い培地オフと20:80の比率で組み合わせたメディア1及び2に、予め温めたメディアと交換してください。この特定の比は3日間のメディアを変更します。バック37℃、5％CO ₂インキュベーター中に置き細胞。
5. 100比率：10日目に、0で混合メディア1と2を作る。吸引除去古い培地オフと0の組み合わせメディア1及び2に、予め温めたメディアと交換してください：100の比率。この特定の比率で毎日メディアを変更します。細胞は、完全に定義異種非含有のメディアに今ある。バック37℃、5％CO ₂インキュベーター中に置き細胞。
   注：この全体の変換プロセス中に、18ゲージ針を用いてルーチン継代適切コロニーサイズおよび密度を維持するために必要とされる。 P上のプランコロニーサイズ、フルエンシー、および分化のもとにすべての4から5日間、細胞をassaging。
6. メーカーが推奨するように定義される異種非含有基質と6ウェルプレート中でもコート1。
7. 機械的に通過コンフルエントも、すでに18ゲージ針で6ウェルプレートから、異種非含有培地条件に変換する。重要なことは、事前条件メディアに継代する前に、1時間1X ROCK阻害剤を用いて細胞に（組み合わせたメディアは2）新しいメディアを配置。
8. セルに転送されていることを新しいプレートから合成基質溶液を吸引する。旧版からの幹細胞塊を含むすべてのメディアを取り外し、新しいプレートに移す。
9. （一度インキュベータ内部に直接どのような方法でタッチされていない理想的なプレート）バック最小限の物理的擾乱による2日間、37℃、5％CO ₂インキュベーター中に置き細胞は最大付着を可能にする。
   注：細胞は、毎日のメディアの変更が必要になります。継続的passaginG 4日ごとに重要になります。最適なESC様形態（高い核 - 比）を有するコロニーの一部のみが、21ゲージ針を通路使用。これはよく成長し、最終的に均質なコロニーが得られる適切なhiPSCコロニーのための選択を保証します。コロニーのようなESCの導出に全体的な時間は、初期の複合メディアを変更した後15〜20日の間です。
10. 18ゲージの針を使用して、最初のクロスハッチによりコロニーをすべてGMPグレードのポスト切除hiPSCsダウンフリーズ。 200μlのピペッターを使用してオフにすべてのピースを持ち上げて、4℃で5分間200×gで15ミリリットルコニカルバイアルと遠心分離機に細胞を含むすべてのメディアを転送。
11. 細胞は遠心分離されていますが、冷凍メディアは冷たい組み合わせたメディア2等量のからなる7.5％の最終DMSO濃度で凍結培地作る。
12. 細胞をペレット化した後、古い培地をオフに吸引し、冷凍メディアでペレットを再懸濁ワイズドロップします。すぐにTRバイアルを凍結し、-80℃の冷凍庫に入れてansfer。

5.キャラクタライズGMPグレードのポストを切除hiPSCs

1. 多能性マーカー、変換後の適切な発現を確実にするために、3 QPCR方法論に従うステップで述べたのと同じ手順で、表1に列挙されたプライマーを使用してキー多能性マーカー（SOX2、OCT4およびNANOG）の発現を定量するためにQPCRを使用してステップ3に記載されているものと同じ手順。
2. 使用は、以前に公開¹⁰のキットに記載されている標準的な条件に従って、非ヒトシアル酸Neu5Gcを（N -glycolylneuraminic酸）を検出するためにフローサイトメトリー。
3. 穏やかに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて細胞を細胞培養プレートを洗浄する。
4. 室温で5分間1×解離試薬を用いてコロニーを解離する。
5. ステップ5.4の5分間のインキュベーション時間の間に設けられ、ブロッキング溶液（準備氷冷したPBSでのエージェントのブロッキング0.5％とすることでキット）。
6. フローサイトメトリー分析のためのチューブの以下のセットレーベル：未染色を。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）DAPI。対照抗体1：200;一次抗体1：200。二次抗体を1：200のロバ抗ニワトリのIgG（H + L）。サンプルのMEF。マトリックス上のサンプルのポストを切除細胞;と合成基質上のポスト切除した細胞のサンプル。
7. 穏やかに15 mlのコニカルチューブに溶液および転送コンテンツをブロック2 mlを加えることにより、ステップ5.4からの細胞凝集体を取り除く。 4℃で5分間80×gで遠心し。
8. ステップ5.7で述べたようにソリューションや遠心分離機をブロックで細胞を2回洗浄する。
9. 静かに各抗体の対応する希釈体積を有するブロッキング溶液100μl中およそ1×10 ⁶細胞を再懸濁する。穏やかが1時間4℃で揺らしながらインキュベートする。
10. ステップ5.8のように洗浄を3回繰り返します。
11. 希釈富栄400μlの細胞ペレットを再懸濁1（キットから）ffer：ステップ5.6の下にリストされているように、チューブ2、6、図7、図8のためのDAPIの100。
12. 40μMストレーナーを通してひずみ細胞とは、フローサイトメーターを介して実行。

結果

我々はSTEMCCAレンチウイルスベースの再プログラミングアプローチを用いて、臨床グレードの因子フリーhiPSCsを導出するためのプロトコルを提示する。 図1Aは、MEFの層上STEMCCAアプローチを再プログラミングした後に、三つの異なる予め切除hiPSC系統の代表的な写真を示す。 STEMCCAの再プログラミングアプローチの主な利点は、異なる研究グループと場所で、複数の科学者によって?...

ディスカッション

私たちは、要因のないhiPSCsを導出し、将来ヒトの治療における下流細胞分化のためのGMPグレードの条件にこれらの細胞を変換することにより、それらが臨床的に関連することの方法論について説明します。このプロトコルは、種々の細胞型に広く適用可能であるが、我々が原因の患者からの抽出の容易さとパーソナライズされたヒトの治療への適用のために、ヒト皮膚線維芽細胞を再プログ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5%	Invitrogen	15400-054	Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Basel, Switzerland)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium	Lonza (Basel, Switzerland)	12-769E
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatin, from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/transfection agent	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-well plates	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-well plates	VWR	29442-042
10-cm plates	Sigma-Aldrich	Z688819
18-gauge needle	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-gauge needle	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Combined media 1	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media			Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.