Isolierung und Exzision Murine Aorta; Eine vielseitige Technik in das Studium der Herz-Kreislauf-Krankheit

Zusammenfassung

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Zusammenfassung

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Einleitung

Die Aorta spielt eine zentrale Rolle in der kardiovaskulären Funktion Versorgung des Körpers mit Sauerstoff angereicherte Blut und ähnlich wie andere Teile des Körpers, ist anfällig für Krankheiten. Gemeinsame Aortenerkrankungen zählen Atherosklerose und Aneurysma, das die Ergebnisse der genetischen und Umweltfaktoren wie Ernährung, Rauchen und Bewegungsmangel ¹ sind. Atherosklerose ist die Abscheidung eines calcium- und lipidbasierte Tafel an der Aortenwand typischerweise bei Patienten mit chronischer Hyperlipidämie ² gefunden. Aneurysmen werden durch Abbau von Strukturkomponenten der Aorta und Verdünnung der Gefäßwand, gefolgt von einem erhöhten Durchmesser auf, der letztlich dazu führen könnte zum Bruch ³ gekennzeichnet.

Tiermodelle sind wichtige Werkzeuge verwendet, um den Mechanismus der Erkrankung und die Wirksamkeit von potentiellen Behandlungen zu untersuchen. Gemeinsame Tiermodellen in der kardiovaskulären Forschung, insbesondere der Forschung untersucht Gefäß- und Stoffwechselerkrankungensind gentechnisch veränderte Mäuse Fettwerte wie Apolipoprotein E Gen-Knockout und Low Density Lipoprotein-Rezeptor-Gen-Knockout-Mäusen ⁴ zu ändern. Die Mehrzahl von Methoden, die Mechanismen der Erkrankung und die Wirksamkeit der Therapie zu bewerten würden die Isolierung und Entfernung der Aorta umfassen.

Sobald die Aorta wird lokalisiert und isoliert ist, kann die morphometrische Analyse bestimmt werden, wie Gegenwart Aneurysma, typischerweise als eine Zunahme von mehr als 50% einen Durchmesser von ⁵ definiert ist. Nach in situ Analyse notwendig abgeschlossen ist, können die Aorta für die weitere Analyse herausgeschnitten werden. Ein exzidierten Aorta schockgefroren werden, um molekulare Studien wie zB Protein und / oder Gen-Expressionsassays oder Verhaltensweisen befestigt unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd und später eingebettet, geschnitten und für eine histologische Analyse gefärbt. Die histologische Analyse der Aorta können Gemeinsamkeiten der Aorten-Krankheit so wie strukturelle Verschlechterung, Plaquebildung und Infiltration von Leukozyten zeigen ^{6,7. Zusätzlich kann ein exzidierten Aorta um primäre Zelllinien, einschließlich Endothel- und glatte Muskelzellen, die anschließend für eine Vielzahl von in vitro-Studien 7 verwendet werden können, zu isolieren.}

Derzeit gibt es keine anderen Methoden, um dieses eingehende Charakterisierung der Aorten-Krankheit zu liefern sowie den Forschern Werkzeuge, um Herz-Kreislauf weiter zu studieren. Bildgebungsmodalitäten, wie Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Sonographie sind die nächsten Verfahren morphologisch bewertet die Aorta, dies ist jedoch schwierig, bei kleinen Tieren und Erhalten einer Vorrichtung mit ausreichender Technologie teuer ^8. Immortalisierte Zelllinien können gekauft werden, um mögliche Mechanismen der Erkrankung und der Wirksamkeit von Therapien, die künstlichen Natur dieser Zellen bei der Untersuchung der Auswirkungen auf die Zelllebenszyklus und Apoptose ⁹ Begrenzungs untersuchen.

Das übergeordnete Zieldiese Handschrift, die sterile Isolierung und Exzision des murinen Aorta bei der Untersuchung von Herzkreislauferkrankungen zu demonstrieren.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Cincinnati und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung Nr 85-23 durchgeführt, revised 1996).

1. Vorbereitung der Maus

1. Euthanize, indem das Tier in eine supra Dosis des Anästhetikums, inhaliert Isofluran wirksam. Stellen Sie sicher, primäre Euthanasie über toe Prise als schädlichen Reiz. Sekundäre Methode der Euthanasie, Membranabbaus werden in einer der nächsten Schritt erfolgen. Alternative Methoden können verwendet erteilt Euthanasie gewonnen werden.
2. Sanitizie die Außenfläche der Maus durch Besprühen der Pelz entlang der Bauchregion, in der die ersten Schnitte gemacht werden, mit 70% Ethanol bis zur Feuchtigkeit, so dass das Fell nass ist mit Ethanol und lose / trockene Haare nicht eingeben die Region.
3. Legen Sie die Maus auf einem surgische Bord in Rückenlage mit oberen und unteren Fortsätze verlängert nach außen.
4. Sichere Anhängsel an den Vorstand mit chirurgischen Band.

2. Isolierung des Herz und Aorta

1. Nach der richtigen Positionierung der Maus Verwenden einer Pinzette zu lokalisieren und zu isolieren Bauchhaut nur schlechter als die Schwertfortsatz des Brustbeins.
2. Spannung zu erzeugen, indem Sie den Haut gerade nach oben und mit einer Schere die oberflächliche Haut zu entfernen, indem die überlegenen Teil des Bauchfells und unteren Abschnitt der Brusthöhle.
3. Geben Sie die Bauchhöhle durch Anheben des Schwertfortsatz und macht seitliche Einschnitte gerade schlechter als der Prozess entlang der subkostalen Margen.
4. Präparieren Sie bis in die Brusthöhle, gehen durch die Membran, wobei Sie nicht, um das Herz oder keine größeren Blutgefäße zerreißen.
5. Erweitern Sie die seitlichen Einschnitte in Schritt 2.3 kranial, um die vorderen Teil des Brustkorbs zu entfernen. Wennnotwendig, befreien das Herz aus der vorderen Brustwand mit stumpf.
6. Reinigen Sie die Brusthöhle von fremden Blut und Flüssigkeit mit Hilfe steriler Gaze, um Material zu absorbieren. Sobald der Bereich ist sichtbar, entfernen Sie die Lungen, das Herz und Aorta besser aus.

3. Perfusion von Herz und Aorta

HINWEIS: Um Blut über Herzpunktion erhalten, tun Sie dies nur vor diesem Schritt.

1. Füllen Sie einen 10-ml-Spritze mit 10 ml sterilem eiskaltem 1x Phosphatpufferlösung (PBS), und fügen Sie eine 25-Gauge-Nadel an der Spritze.
2. Die Nadel vorsichtig in der linken Herzkammer.
3. Schneiden Sie den rechten Vorhof, um Druckaufbau von Blutung zu lindern. Perfuse den Inhalt der Spritze in die Maus über 2-3 min.
4. Sterile Gaze an der Öffnung im rechten Atrium zu Perfusionsflüssigkeit absorbieren.

4. Isolierung und Exzision der Aorta

1. Nach Beendigung des perfusion Verwenden steriler Gaze, um alle verbleibenden Flüssigkeit trübt das Sichtfeld in der Brusthöhle zu absorbieren.
2. Setzen die Magen-Darm-Inhalt, indem kaudal durch die Bauchwand, Verlängerung der Inzision in die suprapubischen Bereich. Ziehen Sie die Schnittführung weiter in Richtung der unteren Extremitäten auf bilateraler Ebene zu Hautlappen, die festgenagelt oder ausgeschnitten werden können.
3. Entfernen Sie die Lappen der Leber, Bauchspeicheldrüse, Magen, Milz und Darm, die Aorta besser zu visualisieren. Achten Sie beim Zerlegen der Nähe des perirenalen Region, wie der Aorta ist oberflächlich in den Filialen der Nierenarterien.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einer präzisen und immatrikulieren Weise wie der Gastrointestinaltrakt ist reich an Bakterien, die die Neigung zur Verschmutzung erhöht.
4. Spülen Sie den Bereich mit 1x PBS und entfernen Sie alle Flüssigkeit durch Absorption mit steriler Gaze.
5. Mit einer sterilen Mikroschere und Mikropinzetten, trennen Sie die Hauptschlagader von der Wirbelsäule nach dorsal und ventral der Speiseröhre.Am besten ist es stumpf und Verwendung eines Dissektionsmikroskop für diesen Einsatz.
   HINWEIS: Bei der Isolierung der Aorta, starten kaudal an der iliakalen Bifurkation und bewegen kranial Reinigung und Trennung der Aorta von der dorsalen Oberfläche des Hohlraums oder starten kranial an den Halsschlagadern und Arterien brachiocephalica Sezieren kaudal. Jede Methode geeignet ist und bleibt dem Forscher Komfort.
6. Entfernen Sie mit feinen Mikroschere sicher zu sein, nicht, um einen Teil der Aortenwand entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe. Dies ist wesentlich, um das Potential für Fibroblasten Kontamination zu minimieren, wenn die Kultivierung glatten Muskelzellen der Aorta.

Ergebnisse

Nach Abschluss des Verfahrens wird es eine intakte Aorta vom Herzen stammenden Abstieg in der Brust- und Bauchhöhle mit der Nierenarterien noch angebracht (Abbildung 1A) sein. Von hier aus kann die Aorta in situ abgebildet werden, um morphometrische Änderungen, die in der diagnostischen Untersuchung von Bauchaortenaneurysmen (1B und 1C) sind quantifizieren. Anschließend kann der Aorta entfernt, fixiert und angefärbt, um auf histologische Veränderungen zu s...

Diskussion

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical Tape	3M	1527-1
Sterile Gauze	Dukal Corporations	1312
25 Gauge Needle	BD	305122
10ml Syringe	BD	309604