Gri tonlama Analizi İle Farelerde Saç Dökülmesi Kantitatif Analiz Yeni Bir Teknik

Özet

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Özet

Alopesi erkek tipi saç dökülmesi, polikistik over sendromu ve alopesi areata gibi birçok farklı koşullar, oluşabilir saç dökülmesi yaygın bir şeklidir. Alopesi Kanser hastalarının kemoterapinin bir yan etkisi olarak ortaya çıkabilir. Bu çalışmada, amacımız araştırmacılar doğru değerlendirmek ve alopesi bu çeşitli formları için yeni tedavi yaklaşımları karşılaştırmak sağlayacak farelerde saç dökülmesi, ölçmek için tutarlı ve güvenilir bir yöntem geliştirmektir. yöntem fare üzerinde siyah (veya gri) saç miktarına kaba orantılı olarak meydana hafif emilimini, ölçme, farelerin görüntüleri elde etmek ve süreç standart bir jel görüntüleyici kullanır. Bu şekilde sayısal edilmiştir Veriler daha sonra standart istatistiksel teknikler (örneğin, ANOVA, t-testi) kullanılarak analiz edilebilir. Bu metodoloji, balmumu gelen kemoterapi kaynaklı alopesi, alopesi areata ve alopesi fare modellerinde test edilmiştir. Bu raporda, ayrıntılı protokol pres olduğunuodaklılık doğrulama C57BL / 6 veri ve C3H / farelerin HeJ suşları da dahil olmak üzere bu ölçümleri, gerçekleştirmek için. Bu yeni teknik, göreceli uygulama basitliği, çoğu araştırma laboratuarlarında hazır olan ekipman güven ve objektif uygulayarak, subjektif değerlendirmeler daha sağlamdır nicel değerlendirmesi dahil bir dizi avantaj sunmaktadır. Farelerde tüylerin miktarının gelişmeler alopesi modellerinin çalışma artırmak ve klinik öncesi çalışmalarda umut verici yeni tedavilerin değerlendirilmesi kolaylaştıracaktır.

Giriş

Alopesi (saç dökülmesi) çok farklı nedenlere bağlı bir psikolojik ve duygusal sıkıntı olay olabilir. Erkek tipi kellik 35 yaş ¹ ile erkeklerin yaklaşık üçte ikisini etkileyen alopesi en sık nedenidir. Saç dökülmesi benzer bir model polikistik over sendromlu kadınlarda görülebilir. Bu hastalıkların her ikisinde de, saç dökülmesi aracılı androjen. Alopesi zamanda nüfusun ² 1.7% etkileyen bir otoimmün hastalık, alopesi areata gibi oluşabilir. Alopesi kemoterapi ³ gibi bazı tıbbi tedaviler, bir yan etkisi olarak ortaya çıkabilir. Kemoterapi hastalarının büyük bir oranı (% 65-85) alopesi ^4,5 ölçüde deneyim. saç dökülmesi psikolojik sonuçları iyi kemoterapi ortamda incelenmiştir. Kemoterapi kaynaklı alopesi anksiyete, depresyon, olumsuz beden imgesi, alçaltılmış benlik saygısı ve ^6,7 refah azaltılmış anlamda neden olabilir. Yüksek pekadın kanser hastalarının rcentage (47-58%) kemoterapinin en travmatik yönü olarak saç dökülmesi düşünün ve% 8 düşüş tedaviye kadar saç dökülmesi ^4,6 korkusuyla. Saç dökülmesi ^8,9 psikolojik ve hatta tıbbi sonuçlarını azaltmak için tedavi desteklemek için androjenik alopesi kanıtlar da vardır. Aynı şekilde, Alopesi areata ciddi psikolojik sonuçları ² olduğu rapor edilmiştir ve saç dökülmesi yamalı doğası saç dökülmesi çoğu diğer nedenleri daha tatsız kozmetik sonuç yol açabilir.

Hafif anti-androjenik etkileri (örneğin, spironolakton) sahip ilaçlar alopesi için bir tedavi olarak sınırlı başarı ile kullanılmış iken, alopesi için birinci etkin bir ilaç minoksidil ¹⁰ idi. Bu antihipertansif saç büyümesine neden gözlenen bir yan etkisi vardır ve şimdi alopesi pek çok biçimi için topikal bir tedavi olarak kullanılır. Ancak, tepkiler, bazı konular yalnızca yavaş gösteren, genellikle eksikGerçek büyütme ¹⁰ yerine saç dökülmesi ing. Finasterid kısmi sistemik androjen blokajı pahasına androjenik alopesi iyileştirmeler sonucunda, dihidrotestosteron için testosteron bloke dönüşüm II 5α-redüktaz tip rekabetçi bir antagonistidir. Uzun vadeli (10 yıl) tedavisi ile yanıt oranı% 50 civarında ¹¹ vardır. Genel olarak, bu alandaki önemli araştırma rağmen, hala saç dökülmesi için yeterli tedavinin yoktur.

On yıllardır, bilim adamları ve klinisyenler klinik denemelerde derisi saç büyümesini ölçmek için yöntemler araştırılmıştır. Alopesi tedavi ilaçların geliştirilmesi ile, saç büyüme ve tedaviye özellikle, tepki ölçme, güvenilir, ekonomik ve minimal invaziv aracı için daha büyük bir ihtiyaç olmuştur. Saç dökülmesi bozukluğu olan hastalarda saç yoğunluğu kesin bir ölçümü için görüntü analizi tekniği techniqu kullanarak çeşitli geçmişte, tutarlı ve geçerli sonuçlar eldedijital görüntü ¹² analizi, tek tek kılların görüntü analizi ve cilt ¹³ lezyonlar, ve tanımlanmış bir kafa derisi bölgesi ¹⁴ saç kütlesi ölçmek için mikroskobik tarama dahil olmak üzere, es.

Yukarıdaki yöntemler, saç klinik deneylerde müdahaleler büyüme teşvik etmek için etkinliğinin gelişmiş bir değerlendirme temin ederken, ne yazık ki, bu yöntemler, klinik öncesi araştırmalarda kemirgen çalışmaları uygulanmamıştır. Amacımız araştırmacılar daha doğru değerlendirmek ve alopesi çeşitli formları için yeni tedavi yaklaşımları karşılaştırmak sağlayacak farelerde saç dökülmesi, ölçmek için tutarlı ve güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Biz kahverengi veya siyah saçlı farelerde saç yoğunluğu hızlı ve güvenilir ölçümü sağlayacak en laboratuvarlarda hazır ekipman kullanarak bir metodoloji geliştirdik. Bu metodoloji waxin gelen kemoterapi kaynaklı alopesi, alopesi areata ve alopesi fare modellerinde test edilmiştirörn. Ayrıntılı bir protokol doğrulama C57BL / 6 veri ve C3H / farelerin HeJ suşları da dahil olmak üzere bu ölçümleri, performans sunulmuştur. Bu teknik saç gövdesine pigmentlerden ışık emiliminin tespit dayandığı için, beyaz fareler veya Albino farelerde saç büyümesi tespit etmek için kullanılamaz.

Protokol

Etik Beyanı: hayvanları içeren tüm çalışmalar kurumun IACUC tarafından onaylanmış olması gerekir (aşağıdaki veriler için, protokoller Montefiore IACUC, protokol # 11-6-240 ve # 13-7-100 tarafından onaylanmıştır). Fotoğraf sırasında hareketsiz tutarak tek bir amaç için belirtilen Hayvanlar hafif anestezi sağlanır, bu protokol için gerekli hiçbir acı prosedürler vardır.

Fotoğraf 1. kazanılması

1. Basılı metin ile kağıt kullanılarak jel görüntüleyici için görüş Set odak ve saha. Fotoğraflandı bölgede ışık kaynağının tekdüzelik doğrulayın. , Bütünlüğü sağlamak bir yansıtıcı fotoğrafçılık için ışık kaynağı yerleşik bir jel görüntüleyici kullanmanıza yardımcı olmak için. Bu daha gri tonlama analiz için uygun değildir hayvanın bir siluet yaratacak gibi, bir transillüminasyonu ışık kaynağı kullanmayın.
   NOT: Bu biraz ilgi (ROI) bölgede optik ortalamasının sağlayan odak, dışarı fare koyun ve olacak olacakÇevrede çok küçük (yani, <10 piksel) bölgeler için quantal hataları azaltmaya yardımcı olur. Ilgi büyük bölgeleri ayarı odaklanarak bu reşit etkilenmez, ne de hayvanın büyüklüğüne farklılıklardan etkilenecektir.
2. Ketamin (100 mg / ml) / ksilazin (20 mg / ml) ile hayvanların anestezisi (2: 1), bu hızlı anestezi etkisi ve hızlı bir iyileşme sağlar ve çok sayıda hayvan çekim için en uygun olarak.
   NOT: Hayvan hala fotoğraf izin için yeterli zaman Anestezi teyit edilir. Hayvanlar genellikle 10-15 dakika içinde bu ışık anestezi kurtarmak gibi, veteriner göz merhem kullanılmasını tavsiye etti.
3. (Yakın olarak mümkün paralel) dikey hizalama jel görüntüleyici üzerinde anestezi hayvanları yerleştirin.
   1. Dorsal fotoğrafları için, genişletilmiş uzuvları ile yüzüstü pozisyonda hayvanları yerleştirin.
   2. Ventral fotoğrafları için, hayvanlar yanal döndürülmüş değil özen, yatar pozisyonda hayvanları yerleştirin.
4. Fotoğraflanan bölgede gri tonlama standart yerleştirin.
5. Erişim kapağını kapatın. Önemli: Ortam ışığı maruz varyasyonları tanıtabilirsiniz.
6. Edinimi lineer aralığında ilgi bölgeyi yerleştirir bir pozlama F-stop Set (F-stop okuma).
   NOT: Görüntü doymuş nerede En sistem gösterecektir.
7. Fotoğraf çekmek.
8. Değişim artan ya da standart ve ilgi bölgesi hem satın alma (referans bir lineer aralıkta kalması, 1 F-stop azaltarak lineer aralığında ilgi bölgeyi yerleştirir başka pozlama ayarı F-stop F- dur).
9. Fotoğraf çekmek.
10. Fotoğrafçılık tamamlandıktan sonra, bir ısınma masaya hayvanları yerleştirin ve sternum yatma korumak kadar monitör. Kafeslerine hayvanları dönün. Kez tüm hayvanlar tamamen iyileşti vivaryum hayvanların grubu döndürür.

Işık Emme 2. sayısallaştırılması

1. Hayvanların görüntülerde ilgi Mark bölgeleri jel görüntüleyici yazılımı sağlanan kullanarak.
   1. Bütün hayvan dorsal görünümü için, mümkün olduğunca yanal kadar uzanan, alt ekstremite, üst ekstremite uzanan dikdörtgen ya da oval bir görüntü kullanın şekilde Şekil 1A gösterildiği gibi kutunun hiçbir kısmı hayvanın arkasına ötesine uzanır.
      NOT: Bir de bir serbest elle çizim aracını kullanarak ilgi alanı işaretlemek olabilir.
   2. Pelvik bölgeyi kapsayan bir ve Şekil 1B gösterildiği gibi göğüs bölgesini kapsayan bir: Bütün hayvan ventral görünüm için, 2 dikdörtgenler kullanın.
   3. Uygun faiz, yani, ilaç uygulama yeri, işareti daha küçük bir bölge için.
2. Gri tonlama emme standart faiz Mark bölge (ler).
3. Ilgi işaretli bölgelerin her Tutanak emilim.

3. Analiz

Emme seviyeleri obtaineilgi alanlarının d fotoğrafları arasında karşılaştırma için arka standart normalize edilmesi gerekebilir. emilim maruz kalma ilişkisi log-log (yani, ilişki günlüğü (maruziyet arasındaki lineer) ve log (emme)) 'dir. Bu ilişkiyi kullanarak, ilgi bölgenin emme emilimleri farklı zaman noktalarında (bir çalışma protokolü kapsamında, yani seri ölçümler) alınan da dahil olmak üzere farklı fotoğraf arasında doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlayacak bir standart arka plan değerine normalize olabilir. Bu düzeltmeleri gerçekleştirmek için prosedür isteğe adımlar 3.1 ve 3.2 ayrıntılı.

1. Gri tonlama emme standart elde edilen değerleri kullanarak günlük (absorpsiyon) vs log (maruziyet) ve (İsteğe bağlı) Arsa eğrisi.
2. Aşağıdaki gibi (İsteğe bağlı) Her fotoğrafın standart varyasyonları için ayarlayın:
   1. S belirlenen (referans için ve F-stop (adım 1.6 belirlendiği gibi) okumak için F-Stop seçin) 1.8 TEP.
   2. Okuma F-durağında tüm fotoğraflarda standart ortalama emilimini hesaplayın. Bu ortalama Referans Standart Değeri (RSV) 'dir.
   3. (Delta-YG-1, delta-YG-2 ... ..delta-YG-X) standardına (delta-S) ve her tanımlanmış ROI için her fotoğrafta okuma ve referans F-stop ayarları arasında emilim farkı hesaplayın
   4. Aşağıdaki gibi her ROI için düzeltilmiş emilimi hesaplayın: Düzeltilmiş emilimini (ROI-X) = Emilimini (ROI-X) okuma F-durağında + (RSV - standardın emilimi okuma F-durdur) * (delta-ROI-X / ö = S)
3. Deneysel verileri derlemek ve sürekli değişkenler için standart istatistiksel teknikler kullanılarak veri analizi yapmak (yani, ANOVA, t-testi).

Sonuçlar

Bu teknik C3H / HeJ engrafted fareler, ¹⁶ areata alopesi fare modeli kullanılarak valide edildi. Bu hayvanlar zamanla ilerler küresel saç kaybı gelişebilir. Ancak, saç dökülmesi yamalar oluşur ve önemli değişkenlik tanıtan ve nitel değerlendirmeler engellemekle, bir fare diğerine değişebilir. Bu model geçerliliği bir değerlendirme olarak fare üzerinde farklı konumlarda optik yoğunluk ölçümleri arasındaki ilişkiyi test etmek için bir fırsat sağladı.

...

Tartışmalar

Bu raporda ayrıntılı bir açıklama kemirgenlerde saç dökülmesi ölçülmesi için yeni bir teknik sağlanmaktadır. Bu teknik, en laboratuvarlarda hazır olan görüntü elde etme ve analiz, ekipman için bir jel görüntüleyici kullanır. ölçümler teknikte küçük varyasyonlar (Şekiller 4-5), tutarlı olduğu gösterilmiştir ve tedavi modelleri görme saç kaybı (Şekil 6) bir dereceye kadar iyi bir korelasyon vardır. Bu teknikler başarıyla alopesi ¹⁷ deney...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest, http://www.imatest.com/docs/q13/		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study