Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

Резюме

Данио является популярным инструментом для моделирования хронической болезни почек (ХБП). Тем не менее, их небольшой размер делает невозможным оценить функцию почек с использованием традиционных методов. Мы описываем почек флуоресцентный краситель оформление анализ ^1, что позволяет количественный анализ рыбок данио функции почек в ЦП.

Аннотация

Данио рерио эмбрион предлагает послушный модель для изучения органогенеза и модель человеческих генетических заболеваний. Несмотря на свою относительную простоту, данио почки развивается и функционирует почти так же, как и людей. Основное различие в конструкции почки человека является наличие миллионов нефронов по сравнению с данио, который имеет только два. Однако, упрощая такую ​​сложную систему в основных функциональных узлов способствовал нашему пониманию того, как развивается почечная и работает. У рыбок данио, срединный находится клубочек отвечает за начальный фильтрации крови в двух pronephric канальцев, что расходятся, чтобы запустить в двустороннем вниз эмбриональной оси до слияния друг с другом в клоаку. В pronephric трубочки обильно населены подвижных ресничек, которые облегчают движение фильтрата по сегментной трубочку, позволяющая обмениваться различными растворенных веществ, прежде чем, наконец, выход через клоаку ^2-4. Многие гены, ответственные за ХБП, IncЛУДИНГ, связанные с ресничек, были изучены у рыбок данио ^5. Тем не менее, основным отступать было трудность в оценке данио функции почек после генетической манипуляции. Традиционные тесты для измерения дисфункции почек у людей оказались без поступательной к рыбок данио, главным образом из-за их водной среды и небольшого размера. Например, это физически невозможно извлечь кровь из эмбриональных поставлена ​​рыбы для анализа мочевины и креатинина содержанием, так как они слишком малы. Кроме того, данио не производят достаточно мочи на анализ на простых протеинурии "щупе», который часто осуществляется в ходе первоначальных пациента экзаменов. Опишем флуоресцентного анализа, который использует оптическую прозрачность данио, чтобы количественно контролировать зазор флуоресцентным красителем, с течением времени, из сосудистой и наружу через почки, чтобы дать считывать из функции почек ^1,6-9.

Введение

Почки человека играет решающую роль в фильтрации обмена веществ из крови и выделение необходимых растворенные вещества для поддержания клеточного гомеостаза. Есть ряд генетических заболеваний человека, которые вызывают дисфункцию почек. Наиболее распространенным наследственным почечная болезнь аутосомно-доминантное заболевание поликистоз почек (ADPKD) характеризуется развитием наполненных жидкостью мешочки в пределах почечных канальцев; Ущерб, причиненный cystogenesis вредно для функции почек ^10. ADPKD имеет возникновение 1: 800 - 1: 1000 и составляет 8 - 10% больных в терминальной стадии почечной недостаточности (ESRF) ^11. Несколько генов были вовлечены, чтобы вызвать ADPKD включая Polycystin-1 (PKD1) и -2 (PKD2), что составляет примерно 85% и 15% случаев, соответственно ^12,13. Кроме того, генные продукты для PKD1 и -2 локализуются в реснички и имеют основополагающее значение для ресничек ^14,15. Существует в настоящее время признается семья генетических нарушений у человека, известных какв цилиопатий, которые влияют на реснички функцию и приводят к CKD ^16.

Все большее число генетических заболеваний человека, влияющих на развитие ресничек и функцию привлекает всеобщий интерес к этой когда-то считался рудиментарным органеллы. Ресничка, похожие на волосы сотовой выступ, обогащается с рецепторами и ионными каналами, необходимых для трансдукции ключевых событий клеточных сигналов. Реснички состоит из микротрубочек на основе аксонемы, как правило, структурированного на девять радиально расположенных микротрубочек дублетов с или без центрального пары синглетных микротрубочек. Структура axonemal определяет тип и режим работы цилиарной действий. Устройство микротрубочек 9 + 2 дает подвижность в реснички, где он используется в движении жидкости через эпителиальные поверхности. Конфигурация 9 + 0 не является подвижны, но, как полагают, в основном функции в мероприятиях, клеточной сигнализации ^17. Помимо ХБП, последствия мерцательной дисфункции набор характеристикаЦилиопатии функции, которые включают в себя, ожирение, дегенерации сетчатки, полидактилия и когнитивные нарушения ^16. Однако, CKD является одним из самых вредно для качества в жизни пациента и, следовательно, основной движущей силой развития соответствующих в моделях естественных условиях для цилиарной связанных ХБП.

Данио является отличной моделью для понимания этиологии человеческих генетических заболеваний. Их быстрое развитие, производство большого количества яиц, прозрачной ткани, и экс роста внутриутробного позволяет данио процессы развития для визуализации и биологические явления манипулировать со значительным легкостью. Гены могут быть генетически изменено с помощью недавние успехи инструментов для редактирования генома (CRISPR ¹⁸ и Talens ^19), сбит с использованием антисмысловой технологии морфолино ^20, или его фармакологически регулируется путем добавления соединений в их водной среды. Действительно, данио предложить платформу для проведения электроннойxperiments, которые не разрешающим в других моделях на животных. Несмотря на то, данио относительно простые позвоночные (по сравнению с людьми), они имеют много функционально консервативные органы, гены и сигнальных процессов общего с людьми. Например, данио почки удивительно похожи по структуре и функции по сравнению с людьми ^21,22. Однако, в отличие от почек млекопитающих, который развивается через последовательность фаз, каждая отмечена более развитой почки (предпочки, мезонефрос и metanephros), эмбриональные данио только развивает предпочки, наиболее незрелые формы почки. Несмотря на то, миллионы нефронов можно найти образуя строительные блоки почки млекопитающих, данио эмбрион обладают только два. Клубочки, которые позволяют для первоначального фильтрата крови, сливают на средней линии вентральной только в аорте. Фильтры крови через клубочки в pronephric канальцев, которые работают в каудальном вдоль оси, фьюзинг до выхода через клоаку. Pronephric Туbules сильно реснитчатые с подвижных ресничек, которые разрешающим к потоку фильтрата в направлении хвостовой выходе ^3,4. Этот простой pronephric структура сохраняет данио гомеостаза через несколько недель роста личинок, где они в конечном итоге превратиться в более сложной мезонефрос структуры ^21. Тем не менее, данио никогда не развивается metanephros ^21. Несмотря на рыбок данио идиосинкразии, данио нефрона сегментирован с профилями экспрессии генов равные тому, что наблюдается у млекопитающих и, таким образом, предлагает не имеющие аналогов в естественных условиях модели для нефрогенеза ^3,22.

Регулярно пациенты испытывали на функцию почек через серию крови и в моче испытаний. Обычно кровь анализировали на растворенных солей, мочевины и креатинина. Высокие уровни мочевины, креатинина и аномальных концентраций соли указывают на проблемы с функцией почек. Анализ мочи с помощью колориметрического щуп обнаруживает аномальные уровни белка, Blood, гной, бактерии и сахар присутствует в образцах мочи. Такие тесты обычно требуют приблизительно 30 мл мочи или 5 - 10 мл крови. Это было трудно перевести эти типы анализов с малым в естественных условиях модельных организмов, таких, как данио, главным образом, из-за невозможности характера сбора достаточного количества крови или мочи для выполнения анализа. Здесь мы обращаемся за отсутствия соответствующих данио испытаний функции почек и описать инновационную технологию для ее изучения. Вводя флуоресцентного красителя в кровоток, мы можем контролировать и индивидуально количественно с течением времени фильтрации и экскреции флуоресцентного деятельности из крови через почки. Этот метод может быть использован для изучения повреждение почек, вызванное болезнью, которую мы приведем пример того,.

протокол

О себе Этика: Animal обслуживание, земледелия и процедуры определяются и контролируются в соответствии с Законом 1986 года Все эксперименты на животных были осуществляется на основании лицензий, выданных внутренних дел (PIL г. № 70/7892) в соответствии с биологическими животных (научные процедуры) Services Group Management и этический комитет Биологическая услуги, SGUL, Лондон, Великобритания. Все усилия были сделаны, чтобы уменьшить количество животных, используемых и уточнить обе процедуры и земледелие для того, чтобы свести к минимуму страдания и повышения благосостояния.

1. Подготовка инструментов, цистит, и флуоресцентный краситель

1. Использование микропипетки съемник и боросиликатного стандартные настенные капилляры (без нитей) Потяните иглы соответствующей длины для микроинъекции (рис 1а).
2. Сделать агарозы формы для ориентации эмбрионов для легкого введения в перикард (рис 1б). Клей примерно десять стекло микроскопа SLиды вместе, чтобы сформировать "лестницу" офсетных слайдов. Для достижения наилучших результатов, используйте падение быстрого набора эпоксидной смолы клея в центре каждого слайда.
3. Вырезать сечение приблизительно 78 мм в длину на полпути через два 10 мл пластиковых пипеток с помощью горелки Бунзена с подогревом скальпель, удалить пипеткой заканчивается по мере необходимости. Приложить и клей (эпоксидная смола) пипеток секции к уложенных стеклах, чтобы обеспечить стабильность, чтобы пресс-форма, чтобы опустить в 90 мм чашки Петри. Сделайте все возможное, чтобы обеспечить слайд совместив углы перпендикулярно блюдо этаже Петри. Дайте время клей, чтобы установить.
4. Литые форму в 2% агарозном раствором, приготовленным в воде рыбы (получен из аквариума). Налейте агарозы в 90 мм чашки Петри и помещают в пресс-форму в верхней части открытой чашке Петри, что позволяет сложены скольжения края, чтобы погрузить под углом в соответствии с агарозном поверхности. Оставьте установить на лабораторном столе в течение 30 мин.
5. Удалить слайд бросок и охватывают слайд-запечатлен агарозы со свежей рыбой водысодержащий Tricaine анестезии (см шаг 1,9) в соотношении 1:25.
6. Сделать растворах родамина декстрана (RD) красителя. Ресуспендируйте родамин 10000 МВт помечены декстрана в автоклавного сверхчистой воды, чтобы сделать концентрацию акций 50 мг / мл. Для микроинъекции, дополнительно разбавить запас до конечной концентрации 5 мг / мл в автоклаве сверхчистой воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пигментные клетки начинают дифференцироваться в данио от 24 ч после оплодотворения (ФВЧ); они могут скрывать флуоресцентные маркеры во время получения изображений.
7. Ингибировать образование меланоцитов с помощью N -Phenylthiourea (ПТУ), который блокирует меланогенеза путем ингибирования тирозиназы. Сделать 0,003% исходного раствора ПТУ растворением порошка в PTU аквариумной воды, тепла раствора при 60 ° С, чтобы полностью растворить.
8. Выдержите данио эмбрионов в раствора метиленового голубого, мягкого фунгицида, чтобы предотвратить грибковые цветы и увеличение продолжительности жизни. Добавить 2 мл метиленового синего раствора, содержащий 0,1% метиленового синего в Ultrapure вода, до 1 л аквариумной воды и использовать в качестве стандартной эмбриона среды.
9. Макияж 15 мМ маточного концентрации Tricaine / этил-3-аминобензойной кислоты соли метансульфокислоты в соответствии с инструкциями в "данио рерио книга" ^23. Обезболить эмбрионов и, следовательно, иммобилизованных их выполнять процедуру микроинъекции.
10. После анестезии эмбрионов, ориентировать их, для работы с изображениями, используя нетоксичные и вязкие свойства метилцеллюлозы. Для того, чтобы препарат 200 мл 3% метилцеллюлозы, охладить 130 мл воды при -20 ° С в течение 30 мин и помещают на лед. Тепло 70 мл воды до 80 ° С в стеклянном стакане, добавить 6 г метилцеллюлозы, и перемешивают с помощью стеклянной палочки, пока все частицы не будут смочены и равномерно диспергируют. Добавьте ледяной водой, перемешивают и оставляют для охлаждения препарат при 4 ° С в течение 30 мин, затем аликвоты в 50 мл пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Понижение температуры позволяет метилцеллюлозы, чтобы стать растворимым. Решение станет толщеа порошковых гидратов. 3% метилцеллюлозы могут быть сохранены без бактериального роста в течение коротких периодов в неделю при 4 ° С или больше при -20 ° С. Убедитесь в том, метилцеллюлоза достиг RT перед использованием.
11. Для выполнения инъекции флуоресцентного красителя в данио использовать стандартный микроинъекции набора (рис 1в). Он состоит из воздушного компрессора, соединенного с системой Регулятор давления, который подает в прямой держатель пипетки для использования с 1,0 наружный диаметр капилляров. Держатель пипетки должны быть размещены внутри MM33 компактной 3-оси управления микроманипулятором прикрепленной к стальной опорной плите с помощью магнитного стенда. Эмбрионы могут быть визуализированы, манипулировать и вводили с помощью стереофонического рассекает микроскопом.

2. данио рерио Животноводство и Предварительный впрыск Лечение

1. Поддержание данио, как описано выше ^23. Используйте аквариум настройку, которая обеспечивает рециркуляции воды, подаваемой при постоянной температуре 28,5 ° C, Кондиционером до рН 6,8 - 7,2 и проводимость 450-550 мкСм бикарбоната натрия и мгновенных океана морская соль, соответственно. Используйте дикого типа или трансгенных линий данио по мере необходимости к эксперименту, поддерживая плотность посадки 15 мужчин до 15 самок на 8 л бак. Установите рыбы-центр фотохимический до 14 часов дневного света между 9 утра - 11 вечера.
2. Данио рерио нерест начинается в начале фотохимического, когда свет включается по утрам. Для обеспечения максимальной яйца могут быть собраны без нарушения рыбу, погрузить разведение танков (содержащие сетчатыми вставками, которые можно приобрести данио специалистов) в дикого типа фондовых танков вечер перед сбором.
3. В день сбора, позволит 30 - 40 мин для рыб на нерест, после чего собрать и промыть яйца, используя ситечко и пресной и морской воды. Депозит очищенные яйца в 90 мм чашку Петри, содержащую эмбриона среды и инкубировать при 28,5 ° С.
4. Лечить эмбрионов с ПТУ подавлять MELANOгенезис. В 8 часов после оплодотворения, трансфер жизнеспособных эмбрионов в минимальном жидкости свежих чашках Петри, содержащих 1: 100 ПТУ, чтобы эмбриона среды и далее не инкубировать при 28,5 ° С до 72 часов после оплодотворения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПТУ может вызвать дефекты развития, если использовать на ранних стадиях, так должно быть ограничено, чтобы опубликовать 8 часов после оплодотворения этапы, но можно лечить, как в конце 24 часов после оплодотворения. Позднее добавление ПТУ не в полной мере блокировать глаз пигментации, но, как правило, успешными и ингибирования образования ствол меланоцитов.

3. Микроинъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: перикард окружает сердце, но отделен для защиты и простоты сердечной движения жидкостью в полости перикарда. Цель этой процедуры заключается в инъекции RD в полости перикарда, это позволяет быстро поглощения красителя к системе сосудов.

1. Загрузка иглы с 6 мкл - разбавляют RD, используя подсказки microloader и закрепите в держателе иглы микроманипулятора. Перерыв конец иглы, используя тонкую Tippред щипцы (рис 1а). Перемещение RD решение до кончика иглы за счет максимального длительность импульса к установке минут, переключитесь обратно мсек по завершении.
2. Используйте микрометра, регулятор давления и уточнения к длине кончика иглы (с помощью щипцов), чтобы настроить размер исключен капли до 100 мкм в диаметре, это приравнивается к 0,5 п громкости (рис 2а).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда поломки иглы, будьте осторожны, чтобы не сломать слишком много от в противном случае он будет делать калибровки объем впрыска трудно. Если необходимо, дополнительно разбить кончик иглы, чтобы увеличить размер капель однако, поддерживать толщину иглы, которая позволяет вход в перикарде без чрезмерного изгиба или повреждения ткани.
3. Перед инъекцией анестезии эмбрионов в зародыше среде, содержащей Tricaine. Настройка 2 х 35 мм чашки Петри, содержащие 5 мл эмбриона среду, этикетка один "Tricaine», а другой «восстановление».
4. Добавить 200мкл фондовом Tricaine к соответствующей маркировкой блюдо. После того, как готовы придать выберите индивидуальный эмбрион на 72 часов после оплодотворения и переноса в минимальной жидкости в чашку Tricaine. Мониторинг активности эмбриона, проверить эмбрион находится под наркозом и обездвижен осторожном перемешивании с помощью усеченного наконечник microloader.
5. Передача под наркозом эмбриона в пресс-формы и ориентировать эмбриона в агарозном желоба так, левая сторона была обращена вверх, позиционирование сердце слева от поля зрения.
6. Впрыскивать RD в сердце, прокалывают перикарда с иглой и вводят 1 NL РД в перикардиальной полости наркоза эмбриона (фиг.2В, правая панель). Извлеките иглу после инъекции. Передача вводят эмбриона в минимальной жидкости к «Recovery блюдо" и контролировать в течение 1 мин. Передача индивидуального эмбриона в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл свежей среды (эмбриона, содержащего ПТУ) и маркировать соответствующим образом.
   ЗАМЕТКА: Перикард является жестким, однако есть примечательный слабым местом на пересечении, где перикарда отвечает Ventro-каудальном глотки арки и спинно-ростральная желток (рис 2B стрелки). Игла должна быть направлена ​​к этой канавке. Когда игла находится в месте, фирма нажатием пальца на верхней части микроманипулятором будет способствовать вступление в полости перикарда.
7. Повторите шаги 3.2 - 3.6, по крайней мере, 10 эмбрионов в экспериментальной группе, поместите каждую рыбу в отдельный колодец и однозначно labelto разрешение индивидуальных экспериментальных прослеживаний. Инкубировать при 28,5 ° C в течение 3 часов.

4. изображений Приобретение

1. В 3 ч после инъекции (ИНН) обезболить эмбрионов, как описано выше, и передать блюдо 35 мм Петри, содержащую 3% метилцеллюлозы. Аккуратно нажмите эмбрионов в метилцеллюлозы и ориентироваться так боковая сторона может быть отображена.
2. Получения изображения эмбриона под УФ, используя фильтр для визуализации OF излучали свет при 570 нм (рис 2С). После получения изображения, позволяют эмбрион восстановить до замены в назначенный хорошо. Получение изображений для всех введенных эмбрионов и далее инкубируют при 28,5 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали флуоресцентный стереомикроскоп с набором TXR фильтра, камера DFC300FX и соответствующего программного обеспечения. Запишите точными настройками сбора для последующего получения изображения.
3. В 24 HPI, приобретают второй раунд изображений, как описано выше. После того, как все изображения были приобретены, как на 3 ИНН и 24 HPI, гуманно избавиться от эмбрионов или использовать для других экспериментальных средств, например, иммуногистохимии.

Обработка 5. Изображение

1. Количественная интенсивности флуоресценции каждого введенного эмбриона, в 3 ИНН и 24 HPI, анализируя изображения, используя ImageJ программное обеспечение НИЗ. Для измерения интенсивности флуоресценции, откройте изображение в ImageJ и указать область интереса (ROI) в 100 PX ² (Edit → Выбор → укажите).
2. Расположите сердце в центре Руа (рис 2С), установите измерения включить среднее серое и область (Анализ → поставленных измерений) и выполнить измерения (Анализ → меру). Заполните для каждого набора изображений, в 3 ИНН и 24 HPI, за и пересадка эмбрионов средние значения серой шкалы в электронную таблицу для дальнейшей обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выбрали фиксированный размер ROI 100 пикселей ^2, так как это включает в себя индивидуальные сердца между эмбрионов. Сердце было выбрано для выполнения измерений из-за его большого размера, что позволяет удобно расположен для измерения флуоресцентного содержание в крови перед входом в почку.
3. Выполнить статистический анализ с использованием соответствующего статистического программного обеспечения. Сравнить группы для статистической значимости с использованием критерия Стьюдента студента.

Результаты

Барде-Бидля синдром (BBS) является редким гетерогенной Цилиопатии, что затрагивает приблизительно 1: 160 000 человек по всему миру ^16. Пациенты с настоящей ряда связанных с этим проблем, включая поликистоз почек, впоследствии пациенты часто необходим диализ почек или трансплантация ^...

Обсуждение

Данио рерио предложить ценный инструмент для моделирования человеческих генетических заболеваний, их использование в качестве научного инструмента для в естественных условиях исследования позволили детально изучить генетический пробоя многих биологических систем, в том числ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404