Die Prüfung auf Geruch Diskriminierung und Habituation in Mice

Zusammenfassung

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Zusammenfassung

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Einleitung

Mäuse sind abhängig von Geruchssinn für die Navigation in neuen Umgebungen, die Suche nach Nahrung, zum Erkennen von anderen Personen und Sexualverhalten ^1-3. Es ist wichtig, dass die Ermittler festzustellen, ob Versuchstieren eine funktionierende Geruchssinn vor der Verabreichung von Verhaltenstests, die Lebensmittel, die soziale Interaktion oder Gerüche bestimmt, um eine Antwort von der Maus zu entlocken einzubeziehen. Anosmie oder die Unfähigkeit, zwischen verschiedenen Gerüchen zu unterscheiden, könnte in falschen Positiven oder Negativen in einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen führen, so einer Maus Fähigkeit zu erkennen und zu unterscheiden Gerüche sollte eingerichtet werden, bevor andere Arten von Verhaltenstests durchgeführt werden.

Das olfaktorische Gewöhnung / Dishabituation Test wurde zuerst in den 1980er Jahren ⁴ beschrieben. Der Test wurde für die Verwendung in Mäusen durch Drs angepasst. Mu Yang und Jacqueline Crawley ^5. Dies ist eine einfache und kostengünstige Test, dass der Prüfer ESTA erlaubtblish, die eine Maus zu erkennen und zu unterscheiden zwischen Gerüchen. Neben der Prüfung Geruchssinn, dieser Test ermöglicht dem Ermittler, um die allgemeine Verhalten der Maus zu beobachten und sollten frühzeitig in einem Testschema durchgeführt werden. Qualitative Beobachtungen bezüglich der Maus die Fortbewegung, Anzeichen von Angst, das Aktivitätsniveau, und die Reaktion auf gesellschaftliche Gerüchen gegenüber Nahrungsmittelgerüche können neue Bereiche, in denen Tests durchgeführt werden konnte signalisieren.

In diesem Test, Wattestäbchen in verschiedene Gerüche getaucht werden einer Maus dreimal in einer Zeile dargestellt. Bei jedem wiederholten Präsentation eines Geruchs wird die Maus an den Wattestäbchen gewöhnen, verbringen weniger Zeit damit es mit jeder weiteren Präsentation. Wenn ein neuer Geruch präsentiert wird, tritt Entwöhnung und eine typische Maus wird mehr Zeit für die Untersuchung der Tupfer, was darauf hinweist, dass es zwischen den aktuellen und früheren Gerüche ⁵ unterscheiden. Dieser Test wird auf eine Maus zu einem Zeitpunkt verabreicht und umfasst eine 45 min nachlimation Periode, gefolgt von 45 Minuten der Prüfung.

Obwohl dieser Test ist einfach durchzuführen kann es verwendet werden, um anspruchsvolle Fragen über die Maus olfaktorischen Systems zu untersuchen. Weitere beliebte Tests des Geruchssinns, wie beispielsweise die Lebensmittel begraben Test, einfach stellen die Anwesenheit oder Abwesenheit von Anosmie. Allerdings ermöglicht der Geruchs Diskriminierung und Gewöhnungstest der Forscher, um festzustellen, dass eine Maus hat nicht nur die Fähigkeit, Gerüche zu erkennen, sondern können zwischen verschiedenen Gerüchen zu unterscheiden. Das Muster der Gewöhnung und Dishabituation verwendet wurde, um festzustellen, ob neue Mutanten können zwischen ^6,7 Gerüchen zu unterscheiden. In einer überraschenden Studie Fadool und Kollegen verwendet komplexe Mischungen von Gerüchen, dass Mäuse mit Gen-Targeting Löschung der Kv1.3 Kanal zeigen, sind "Super smellers", die sehr ähnlich Gerüche besser als normale Mäuse ⁸ unterscheiden kann.

Bei der Prüfung eines neuen Knockout-Mausmodell es sinnvoll ist establish Gegenwart von normalem Verhalten für Grund sensorischen Aufgaben. Wenn früh in einem Testprozeduren durchgeführt, der Geruch von Diskriminierung und Gewöhnung Test gibt ein Ermittler die Möglichkeit, ungewöhnliche Verhaltensweisen zu beobachten. Diese Beobachtungen könnten falsch positive oder negative Ergebnisse in nachfolgenden Tests, zuzurechnen Eigenschaften des mutierten verwechseln sind zu vermeiden. Als Forscher weiterhin Sozialverhalten die Notwendigkeit, grundlegende Riechfunktion überprüfen untersuchen immer wichtiger. Neben der Prüfung Geruchssinn in Mutantenlinien kann dieser Test verwendet werden, um spezifische Fragen, wie beispielsweise, ob eine pharmakologische Behandlung Reaktion eines Tieres auf soziale Geruch Reize gezielt erhöht oder wenn ihre Reaktion erhöht sich auf alle Geruchsreize ansprechen.

Protokoll

Die erwachsenen männlichen Mäusen im folgenden Experiment verwendet wurden, erzeugt und untergebracht in Baylor University bei einer Umgebungstemperatur von 22 ° C, mit einem 14 h Licht und 10 h Dunkelheit (20.00 bis 06.00 h) Tageszyklus. Die Mäuse wurden ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Alle Verfahren, um die Mäuse in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem Tier-Protokoll wurde von der Baylor University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Die Mäuse wurden am späten Vormittag / frühen Nachmittag getestet. Für alle Verfahren unter der Prüfer sollte Handschuhe tragen, um Gerüche zu beseitigen und zu verhindern Kontamination.

1. Herstellung von Non-sozialen Gerüche

1. Bereiten Sie frische nicht-sozialen Gerüche jeden Testtag.
   Hinweis: Der Prüfer sollte Handschuhe verwenden, um die Gerüche vorzubereiten.
   1. Füllen Sie 3 Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Wasser.
   2. Je 100 & mgr; l der Bananenextrakt in eine 15 ml & #160; konischen Röhrchen und 100 ul Mandelextrakt in ein zweites 15 ml konischen Röhrchen für eine 1: 100 Verdünnung.
      Hinweis: Die dritte 15-ml-Tube werden nur Wasser enthalten.

2. Herstellung von Social Gerüche

1. Bereiten Sie frische sozialen Gerüche am Morgen Tests auftreten wird. Erhalten soziale Gerüche aus zwei Käfige, die für mindestens drei Tage gereinigt wurden, und die gleiche Anzahl von Mäusen. Erhalten Sozial Gerüche aus Mäusen des gleichen Geschlechts wie der Testperson.
   Hinweis: Es handelt sich um bei Raumtemperatur gelagert werden und sollte innerhalb von 4-6 Stunden verwendet werden, um starke und konsistente Geruch zu halten.
   1. Ermitteln Sie, wie viele soziale Geruch Wattestäbchen erstellt werden müssen: jede Maus, die getestet wird mit drei Abstriche aus sozialen Geruch 1, und drei von sozialen Geruch 2 vorgestellt.
   2. Bereiten sozialen Gerüche durch Abwischen ein Wattestäbchen im Zickzack über den Boden eines schmutzigen Käfig. Schütteln Sie überschüssiges Bettfesthalten an der Spitze.
   3. Shop Tupfer in große Gläser mit Deckel oder in Bechergläsern mit Parafilm bedeckt. Bestimmen Sie einen Behälter für die soziale Geruch 1 und einen zweiten für die soziale Geruch 2.
2. Pflegen Geruchsquelle Käfige außerhalb der experimentellen Testraum.

3. Akklimatisierung des Test-Maus

1. Setzen Sie auf Handschuhe und wiegen Sie die Maus zu testenden und individuell in einem sauberen Käfig mit einem Draht Deckel auf der Oberseite und der Wasserflasche entfernt.
2. Lassen Sie die Maus an den neuen Käfig für 45 min in einem anderen Raum als der Testraum akklimatisieren. Stellen Sie sicher, dass es keine ungewöhnliche Gerüche oder Geräusche im Raum.
3. Als Test dauert etwa 45 min, taumeln die Akklimatisierung Zeiten, indem die nächste Maus, um in einen sauberen Käfig getestet, um direkt vor die Prüfung der aktuellen Maus akklimatisieren werden.

4. Herstellung von den Testraum

1. Zeigen frischen Wattestäbchen, Labor-Band, die Flaschen mit sozialen Geruch Tupfer, die Rohre von non-sozialen Gerüche, eine Mikropipette, zwei Timer und eine Abfallflasche mit einem Deckel in den Testraum.
2. Stellen Sie sicher, dass die Testraum ist weitgehend frei von Gerüchen, laute Geräusche und helles Licht. Tragen Sie keine Duft Kölnisch Wasser oder Lotionen.
   Hinweis: Die Beobachter sollten nicht Kaugummi oder Bonbons während der Testphase und sollte versuchen, ihre Exposition gegenüber starken Geruch Lebensmitteln zu begrenzen.

5. Testverfahren

1. Bringen Sie die Maus gewöhnt in seinem Käfig in den Testraum und platzieren Sie den Käfig auf der Theke in einer Höhe, die bequem für die Anzeige im Sitzen ist.
2. Präsentieren Sie jedem Geruch 3 mal hintereinander für 2 Minuten jedes Mal. Verwenden Sie die Darstellung um, die in Tabelle 1 zu finden sind.
   1. Je 50 ul der Geruchsstoff in dem Duft auf, um die Spitze des Wattebausch getestet und neu Kappe die Geruchsquelle. Heben Sie den Draht Spitze des Käfigs und legen Sie die unscented, Holz Ende der Tupfer in das Wasser Flaschenöffnung, pushing die Länge durch die von der Unterseite des Drahtes an die Spitze. Berühren Sie die Wattestäbchen, um alles, einschließlich Finger, so dass Geruchskontamination vermieden wird.
   2. Fahren Sie mit dem Tupfer durch den Wasserflaschenöffnung zu ziehen, bis etwa 1 Zoll des Baumwoll Ende nach unten hängt in den Käfig. Befestigen Sie das Ende des Holz Tupfer auf die Seite des Käfigs mit Labor Band.
      Hinweis: Achten Sie darauf, den Deckel wieder auf den Käfig fallen zu lassen, was ein lautes Geräusch, das den Test der Maus stören würden.
   3. Sofort beginnen Timing für 2 min. Verwenden Sie einen Timer, um die 2 Minuten Präsentationszeit. Notieren Sie sich die kumulative Zeit verbrachte Sniffing den Geruch während der 2 Minuten-Studie. Graf Schnüffeln das Verhalten des Tieres mit einem separaten Stoppuhr. Aktive Schnüffeln wird definiert, wenn der Nase des Tieres in Richtung auf die Baumwollspitze mit seiner Nase ~ 2 cm oder näher an der Spitze ausgerichtet ist.
   4. Nach dem Abschluss der jeden Versuch, heben Sie den Draht Deckel und entfernen Sie die Wattestäbchen von unten ziehen es durch die unterseite des Deckels (dies vermeidet Geruchsbelastung durch die Verhinderung der Baumwollspitze berührt den Draht). Verschließen Sie den verwendeten Tupfer in einem 500 ml Abfallflasche.
   5. Bereiten Sie und legen Sie die nächste Tupfer und beginnen Timing. Lassen Sie ca. 1 min zwischen jeder inter-trial-Intervall. Fortfahren, bis jeder Duft wurde drei Mal in Folge präsentiert, für 2 Minuten jedes Mal.
3. Sobald die Maus hat alle Prüfungen abgeschlossen ist, leeren Sie den Abfallbehälter, die die verwendeten Wattestäbchen in einem Papierkorb Außenseite kann der Testraum. Rückflug die Maus, um seinen eigenen Käfig.

6. Analyse

1. Analysieren Sie Daten für jede Gruppe pro Geruch Zustand mit Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Newman-Keuls oder eine ähnliche Post-hoc-Test, um festzustellen, erhebliche Habituation (weniger Zeit Sniffing aufeinanderfolgenden gleichen Gerüche) und dishabitutation (mehr Zeit Sniffing einen neuen Geruch).

Ergebnisse

Nach dem beschriebenen Protokoll wurden die Ergebnisse unter Verwendung von zehn Erwachsenen (postnatalen Tag 90 bis 120) männliche C57BL / 6J Mäusen und acht männlichen FVB mixed-Hintergrund Stamm (postnatalen Tag 50-70) aufgezeichnet. Die Prüfung erfolgte durch einen einzigen Untersucher über mehrere Tage durchgeführt. Jeder Punkt auf dem Graphen repräsentiert die durchschnittliche Verweilzeit der Untersuchung eines Geruch.

Wenn das Wattestäbchen in Wasser getaucht wird vorgelegt, ...

Diskussion

Die Ergebnisse in diesem Papier optimal sind für Mäuse. Die Mäuse zeigen eine starke Reaktion auf eine neuartige Geruchs, dann schnell zu gewöhnen. Einer der wichtigsten Schritte bei diesem Verfahren ist die Herstellung der Gerüche. Der Prüfer muss sehr vorsichtig sein, um die Gerüche voneinander zu isolieren, um eine Kontamination zu verhindern. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Präsentation der Wattestäbchen. Der Prüfer muss die beste Lage des Baumwollspitze zu beheben, so dass die Maus können Sie die S...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240