Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumo

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Resumo

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introdução

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

Protocolo

1. Passos para executar no dia anterior ao ensaio

1. Escolha L4 vermes palco para meio de crescimento nematóide fresco (NGM) placas semeadas com um gramado de OP50 E. coli e cultura-los em 20 CO / N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de vermes para permitir O perda de vermes / N.
   1. Apenas animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescer a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para as estirpes que têm atrasos de desenvolvimento, de modo que todos os animais testados são adultos do primeiro dia.

2. Passos a executar no dia do ensaio

1. Preparação para o ensaio:
   1. Realizar ensaios em unseeded 60 x 15 milímetros placas NGM padrão. Seque todas as placas para ser usado em 37 ° C durante 2 horas, com tampas de folga. Para cada ensaio experimental, use quatro placas NGM secas; estes serão a 0 mm e 400 mm placas de ensaio etanol e suas placas de aclimatação de acompanhamento.
      NOTA:A utilização de placas NGM é importante aqui; diferenças na composição dos blocos, em particular, a sua osmolaridade, pode afectar fortemente a resposta à dose de etanol no comportamento, isto é devido, pelo menos em parte, a alterações na quantidade de etanol acumulada pelos animais ^20. Agar NGM é de 160 mOsm.
   2. Após a secagem, pesar cada uma das placas NGM unseeded para ser utilizado no ensaio e tomar nota do peso. Determinar o volume de meio em placas com base no peso de uma placa vazia. Para aproximar a conversão do peso do agar, para o volume, assumir que os meios de comunicação pesa o mesmo que um volume igual de água.
      NOTA: Os resultados mais consistentes foram encontrados com media NGM que desidratadas suficientemente que um volume original de 10 ml tem um volume de pós-secagem entre 8,3-8,9 ml. Uma alternativa para o tempo de secagem é de 2 horas para secar até que as placas atingem esta gama de volume para explicar as diferenças em incubadoras.
   3. Derreta 4 anéis de cobre (diâmetro interno de 1.6 cm) para a superfície de cada uma das placas de agir como currais para os diferentes genótipos ou grupos de tratamento de worms.Grasp cada anel com uma pinça, e o calor de uma chama (em um forte chama de um queimador de Bunsen funciona bem) para cerca de 3 seg. Colocar imediatamente o anel em uma placa enquanto ainda mantém o anel com a pinça para impedi-lo de "salto".
      1. Certifique-se de que o anel assenta plana contra a superfície do agar, pressionando suavemente com a pinça em vários pontos no anel. Ao colocar o anel, ter o cuidado de deixar espaço para mais três anéis.
      2. Derreter os três anéis adicionais de cobre na superfície da placa, tendo o cuidado de colocá-los o mais próximo possível um do outro, de modo que todos os quatro estarão no campo de visão da câmara.
         NOTA: Fazendo uma boa vedação com o agar é essencial para manter os vermes nos anéis durante o ensaio. Anéis que pular na chapa não são susceptíveis de fazer a vedação correta com o agar epode scar o agar, que permite que os vermes de toca e interfere com a visualização dos vermes.
      3. Para cada placa de ensaio preparar uma placa de acompanhamento "aclimatação", que deve ser seco e não inoculada e não receberá qualquer etanol. Coloque quatro anéis de cobre sobre estas placas.
   4. Rotular o fundo das placas ao lado de cada anel com a estirpe sem-fim para ser usado no anel, tendo o cuidado para não escrever no campo de visão do próprio anel. Combinar as etiquetas na placa de ensaio com a sua placa de aclimatação que o acompanha.
   5. Calcula-se a quantidade de etanol a 100% para adicionar a cada placa de ensaio de modo a que a concentração final é de 0 mM ou 400 mM de etanol (em peso por volume). Para cada experiência (n = 1), haverá um 0 mM e 400 uma placa de etanol mM; placas de aclimatação não receber etanol. Adicionar o etanol, pipetando-o em torno da superfície da placa. Use filme de laboratório para selar a placa e permitir que se equilibre no cimo da bancada durante 2 horas.
   6. Quando tiver decorrido 1,5 horas, começa a etapa de aclimatação de ensaio, passo 2.2.
2. Realizar ensaio locomoção: As placas de ensaio
   1. Transferir cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre sobre a placa de aclimatação. Remova qualquer alimento que é visível no agar neste momento raspando suavemente com a pick worm. Variar a ordem em que os grupos experimentais são colocados sobre as placas através de ensaios experimentais de modo a que as mesmas estirpes não são colocados nas placas na mesma ordem em todos os ensaios.
      NOTA: O objectivo é o de transferir os animais para a placa com quantidades mínimas de alimentos, porque se o alimento sobre a placa de aclimatação é transferido para a placa de ensaio os vermes vai agregar em redor dos alimentos e o efeito da droga sobre a locomoção vai ser obscurecida.
   2. Tenha cuidado para não quebrar a superfície do agar com a escolha, pois isso permitirá que os vermes de toca e pode atrapalhar o ensaio. Incubar os vermes à TA durante 30 min.
   3. Certifique-se que há um intervalo adequado entre as iniciações de cada placa. Um experimentador experiente pode mover-se 40 animais, 10 / anel para 4 anéis em <1,5 min, mas qualquer intervalo de até 2 min é aceitável. O ensaio padrão tem gravar filmes em 10-12 min e 30-32 min de exposição tanto para 0 mM e 400 mM de etanol.
   4. Iniciado a placa de aclimatação para a exposição 0 mM e a placa de aclimatação para a exposição de 400 mM a cerca de 2 min e 30 seg para além de permitir a poupança do primeiro arquivo de filme antes do segundo filme deve começar.
   5. Após o período de aclimatação de 30 minutos, transferir os vermes das placas de aclimatação para as placas de ensaio. Transfira os vermes para as placas de ensaio (0 mm ou 400 mm) de etanol na mesma ordem em que foram adicionados à placa de aclimatação, mantendo o controle do tempo entre as conclusões de cada placa. Selar a placa com película de laboratório para minimizar a perda de etanol a vaporização.
   6. Usi, um movimento de escavar com uma picareta verme fina gumes achatada para coletar vermes em cima da pick achatada. Executar a transferência de vermes a partir da placa não inoculada aclimatação à placa de ensaio, sem a utilização de bactérias, o que é comumente utilizados na transferência de vermes, uma vez que ajuda a colar o sem-fim para a retirada.
      NOTA: A velocidade em que os animais são transferidos para esta etapa é muito importante, porque as primeiras vermes sobre a placa será exposta a etanol mais tempo do que os últimos vermes adicionados à placa, e pontos de tempo anteriores podem apresentar alguns efeitos dependentes do tempo. Esta é a principal razão para a rotação que as estirpes são colocados sobre uma primeira placa através de experiências em replicado.
3. Execute Locomotion Ensaio: As filmagens
   1. Use uma combinação de microscópio / câmera que permite a gravação simultânea de todos os quatro anéis no campo de visão (aproximadamente 42x42 mm ² quadrado), como um objetivo 0,5x microscópio, ampliação de 0,8x e uma câmera com um 2048x2048 7,481; m CCD pixel.
   2. Utilize uma iluminação uniforme em todo o campo de vista, que ajuda no reconhecimento de objecto no passo limiar de intensidade (ver abaixo). A "x3" backlight 3 funciona bem.
   3. Imagem os vermes em uma placa posicionada do lado media para cima (tampa para baixo), o que gera contraste que se perde quando se utiliza a luz de fundo em comparação com um microscópio tradicional transmitida fonte de luz.
   4. Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes lapso de tempo dos vermes em movimento. Defina o software para capturar 12 bits imagens em escala de cinza a cada 1 s, como um filme de 2 min (120 frame). Para reduzir o tamanho do ficheiro de saída, mantendo a resolução de imagem suficiente, utilizar um modo de bins de 2x2 para capturar imagens 1024x1024 pixels.
   5. Grave filmes. Começar a gravar um filme 120-frame da primeira placa (0 mM etanol) 10 min após o último vermes foram colocados nessa placa. Salve o arquivo de filme.
   6. Grave a segunda placa (400 mM de etanol). Repita esse processo paraambas as placas com início 30 minutos após a última vermes foram colocados sobre a primeira placa (0 mM de etanol) para capturar os pontos 30-32 min de tempo para cada exposição.
      NOTA: Aguarde o tempo suficiente para salvar os arquivos de imagem depois de cada sessão de captura antes de começar a gravação do próximo prato a ser analisado.
   7. Para futuro à prova de filmes arquivados e permitir que esses filmes sejam abertas e analisadas por outros programas de software de imagem de código aberto de domínio público, como ImageJ ^28, converter uma cópia de cada filme para 8-bit 256 arquivos TIFF em escala de cinzento.
      NOTA: O software de análise de imagem descrito aqui usa um formato de arquivo proprietário.
4. Análise de filmes usando software ImagePro.
   1. Uma vez capturado, analisar os filmes usando Imagem-Pro Plus software ou seu equivalente.
      NOTA: Uma variedade de outros softwares de seguimento de objectos está disponível que foi usado com sucesso para controlar múltiplos C. elegans de uma só vez ²⁹ e talsoftware poderia razoavelmente substituir o descrito aqui como as etapas de identificação objeto são baseadas em princípios semelhantes. O método descrito refere-se a versões com software Image Pro Plus 6,0-6,3 e 7.0, as versões mais recentes de Imagem-Pro Plus software podem ter pequenas diferenças.
   2. Analisar filmes nos segmentos 2-min (120 frame). Em primeiro lugar, aplica um filtro para as imagens para achatar o fundo e aumentar o contraste dos objectos de vermes. Selecione o filtro da seguinte forma: Menu> Processos> Filtros> Acessórios> Nivelar: Parâmetros: Fundo = escuro; Recurso Largura = 20 Pix.
   3. Re-salvar os filmes após a etapa de filtragem, mas sempre manter o filme original em sua forma não filtrada.
      1. Analisar a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse (ROI) que está colocado e dimensionado para se sobrepor com o anel de cobre. Identificar e acompanhar os vermes com o Menu> Medida> Track Objetos ... comando; Isso traz a Rastreamento Djanela Tabela ata. O botão Opções de controle permite faixas específicas a serem excluídos e limitar quaisquer artefatos experimentais.
   4. Sob a guia Auto Tracking, use os seguintes parâmetros: Pista Parâmetros: limite de velocidade (raio de busca) = 400 mm / frame, limite de Aceleração = Auto, comprimento total mínimo pista = 400 mm, tipo de movimento predominante = caótico; Objetos em parâmetros faixas: Permitir faixas parciais = yes, Min comprimento = 21 frames, Acompanhando profundidade previsão = 1 quadro.
   5. Para iniciar o processo de rastreamento, clique no Encontrar Todos os rastreia automaticamente o botão de função para abrir a caixa de diálogo de Contagem / opções de tamanho e a caixa de diálogo Rastreamento. Selecione a opção Manual para a Seleção faixa de intensidade na caixa de diálogo Contagem / Size, que fornece o passo importante limiar que usa a intensidade da escala de cinzentos do worm pixels para destacar um objeto verme para análise e ignorar os mais leves de fundo pixels.
      1. Ajuste o sli limiar de intensidadeders (um para definir o limite superior, um para definir o limite inferior) para criar um intervalo inclusivo que destaca todos os objetos escuros. A gama de 0-1,500 em uma escala de 0-4,095 é um bom ponto de partida para a sintonia fina.
      2. Aplicar um filtro de tamanho de excluir objectos que são maiores e menores do que um único objecto sem-fim, tal como o anel de cobre e quaisquer detritos nas placas. Definir dois parâmetros de tamanho para fazer isso que cobrir tamanhos para vermes individuais em uma variedade de posturas com a medida> Selecionar Medidas item de menu na caixa de diálogo Opções de Contagem / Tamanho. (Intervalo Área: 28,000-120,000 mm ² e gama Perimeter: 600-2,500 mm).
      3. Se uma estirpe mutante é significativamente menor ou maior do que outros animais na chapa a ser analisado, ampliar a gama de configurações de filtro para reconhecimento de objetos para acomodar os diferentes tamanhos das cepas primeiro antes de rastreamento de animais, para que as configurações não precisam ser alteradas meados de análise.
   6. Concluir o processo de rastreamento clicando em Continuar na caixa de diálogo Rastreamento. Visualmente comparar as faixas de saída com o progresso de cada verme no filme para garantir que cada verme é representada a menos que haja uma razão válida para excluí-lo com base nas definições de filtros automáticos. Exclua manualmente faixas que foram produzidos pela presença de objetos não-worm confirmaram que atenderam aos critérios de filtro de tamanho.
   7. Use o software para calcular a velocidade de cada verme entre cada quadro (distância percorrida para o baricentro de um objeto por 1 segundo entre os quadros) e exibir a velocidade média para cada faixa e da velocidade média de todas as faixas para a população de vermes na anel de cobre. Considere esta média final para ser n = 1 em termos de ensaios experimentais. Exportar os dados para um programa de planilha para análises estatísticas e arquivamento de dados.
   8. Uma vez que os dados foram registrados para o primeiro toque na placa, mova o ROI para o próximo anel erepita o processo de rastreamento, sem alterar qualquer um dos parâmetros.
   9. Calcular a velocidade relativa de locomoção por meio de:
   10. Velocidade relativa (%) = tratada (400 mm) Velocidade / não tratada (0 mm) Velocidade x 100.
       NOTA: Diferentes manipulações genéticas, muitas vezes altera a taxa de locomoção basal dos animais. A fim de determinar o efeito do etanol sobre a velocidade de locomoção dos animais e para ser capaz de comparar estes efeitos em diferentes genótipos ou condições, calcular uma velocidade relativa.

Resultados

Os dados representativos (Figura 1) de vários genótipos diferentes e seus controles pareados são apresentados ^8,24; dados foram escolhidos especificamente que as diferenças de destaque nos animais testados. O grau de efeito de 10 min de exposição é considerada a sensibilidade inicial de uma estirpe, que é mostrada nos eixos esquerda na Figura 1B-G. Estirpes mutantes com uma maior velocidade relativa do que o controlo em 10 minutos são considerados como sendo resisten...

Discussão

A neurobiologia simples e ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans fazer o sem-fim um excelente modelo para estudar as bases moleculares dos efeitos do etanol sobre o comportamento. Aqui, nós descrevemos um ensaio que foi utilizado para identificar vários mediadores moleculares e ambientais da resposta comportamental aguda para ethanol ^{8,10,20,24,25.} Este método permite a diferenciação e análise simultânea de dois fenótipos diferentes comportamento de resposta etanol, sensibilidade i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3g/L), agar (17g/L), peptone (2.5g/L), 1 mL cholesterol (5mg/mL in ethanol), 1 mL (1M) MgSO4, 1 mL (1M) CaCl2, 25 mL (1M) KPO4, pH=6, 975 mL H2O
Forceps	Various		e.g. Fisher Scientific #10300
37°C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.