Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Zusammenfassung

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Zusammenfassung

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Einleitung

Transfektion von Nukleinsäuren in Zellen hat eine vielfältige Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Beispiele umfassen (1) Reportergene, die Rolle des anderen Gen Elemente Genexpression zu untersuchen, (2) Protein-Expressionsplasmiden, um das Protein von Interesse überexprimiert, und (3) kleine interferierende RNA die Genexpression herunterregulieren. Durch Manipulation des Expressionsniveaus bestimmter Gene und Messen des Differentialwirkung solcher Manipulationen können Forscher die Genfunktionen in den ausgewählten biologischen Systemen abzuleiten. Nicht alle Transfektionsverfahren die gleichen Transfektionseffizienzen und sogar die gleichen Transfektionsverfahren nicht alle Zelltypen ebenso ¹ transfizieren. Daher verschiedene Transfektionsverfahren entwickelt worden, wie beispielsweise Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran, kationische Lipid-Transfektion, kationische Lipid-Polymer nicht-Transfektion, Elektroporation und Nukleofektion ^2,3.

Transfektion in Makrophagen ist ESPEsondere schwierig aufgrund der Tatsache, dass Makrophagen sind professionelle Phagozyten, die sehr empfindlich gegenüber Fremdmaterialien einschließlich Bakterien stammt (methyliert) DNA ⁴ sind. Einführung fremder DNA aktiviert den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) Weg führt zu der Produktion von Cytokinen und Stickstoffmonoxid ^5,6. Diese aktivierten Makrophagen können dann weniger, die auf die Behandlung, die die Forscher beabsichtigen, zu untersuchen.

Unser Labor routinemäßig transfiziert den RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie mit Luciferase-Reporter-Gene, und wir haben ein Protokoll, das robust genug ist, um die Luciferase-Signal deutlich höher als Hintergrund zu haben ist auch sanft genug für Makrophagen an ihren Ruhezustand bleiben entwickelt, aber. Die Verhaltensweisen der transfizierten Zellen wurden durch ein Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Gen beherbergen, das die Promotorregion des IκBζ (pGL3- IκBζ) bewertet. IκBζ Expression durch die Bakterienzellwand-Komponente Lippe hochreguliertopolyssacharide (LPS) ^7,8 und durch die anti-inflammatorische Cytokin regulierte, Interleukin-10 (IL-10) ^8. Um für die Transfektion Variation unter Brunnen Konto, kooperieren wir Transfektion ein Steuer Plasmid, das das Renilla-Luciferase-Gen (zB phRL-TK) zur Normalisierung Zwecke. Das beschriebene Protokoll wird nach der Prüfung verschiedener Parameter einschließlich Timing Transfektion Typ Transfektionsreagenzien Mengen von Transfektionsreagenzien und von Plasmid-DNA sowie Verhältnis von Transfektionsreagenz Plasmid-DNA optimiert. Die beiden Transfektionsreagenzien in diesem Protokoll enthalten sind (1) eine auf Lipid basierenden Transfektionsreagenz, und (2) ein Protein / Polyaminbasis Transfektionsreagenz.

Protokoll

1. Plasmid DNA Purification

1. Extrahieren von Plasmid-DNA unter Verwendung eines Maxiprep-Kit nach Vorschrift des Herstellers. Resuspendieren Plasmid-DNA in 500 ul TE Puffer.
2. Führen eine Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion und Isopropanol-Fällung Rest bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Die Anwesenheit von LPS stört Transfektion ^9.
   1. Gib 500 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) mit der Plasmid-DNA und kräftig geschüttelt, für 15 sec. Phenol verursacht schwere Verätzungen der Haut und ist ein Narkosemittel so Verbrennungen sind nicht immer das Gefühl, bis es zu schweren Schäden. Führen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion in der Abzugshaube und seien Sie vorsichtig.
3. Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 10 min bei RT. Übertragen Sie 350 ul der obere wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube.
4. Mit 350 ul TE-Puffer zu dem Rohr, das die untere organische Phase enthält. Kräftig schütteln für 15 Sekunden. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 5 Minuten bei RT. Übertragen Sie 350 ul der oberen wässrigen Phase auf den gleichen 1,5-ml-Collection-Tube.
5. In 70 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und gut mischen. Add 700 ul 100% iges Isopropanol. Gut mischen und inkubieren 10 min bei RT. Zentrifuge bei 13.000 g für 10 MiNaT 4ºC. Entfernen Sie den Überstand.
6. Gib 500 & mgr; l 75% Ethanol zu dem Pellet. Wirbel Proben bei 5000 xg mischen und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. DNA in dem Pellet.
7. Öffnen Sie den Deckel des Röhrchens und der Luft trocknen das Pellet bei RT 5 - 10 min. Das Pellet sollte durchscheinend. Gib 500 ul TE-Puffer, um das DNA-Pellet zu resuspendieren. Erwärmen bei 50 - 60 ° C für 10 min, um das DNA-Pellet zu lösen.
8. Die Absorption bei 260 nm (A260) und 280 nm (A280) mit einem Spektrometer. Berechnen Sie die Konzentration von DNA durch Multiplikation der A260-Wert von 50 ng / & mgr; l. Bewerten Sie die Qualität der DNA durch calculating die A260 / A280-Verhältnis. 2.0 - DNA mit hoher Qualität sollte eine A260 / A280-Verhältnis von 1,8 zu ergeben.

2. Zellkultur und Seeding

1. Kultur RAW264.7-Zellen in DMEM, ergänzt mit 9% fötales Kälberserum (DMEM / 9% FCS) in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator. Bei jedem Durchgang, nehmen die Zellen von der Platte durch kontinuierliches Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Passage die Zellen alle 2 Tage, und Samen von 1,5 bis 2.000.000 Zellen auf einer 10 cm Gewebekulturschale behandelt als Lager. Tauwetter ein neues Lager von Zellen alle 5 - 6 wochen.
2. Am Tag der Transfektion wurden Samen 200.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in einem Volumen von 500 & mgr; l DMEM / 9% FCS. Inkubieren der Zellen für 4 Stunden in den 37 ° C-Inkubator.
3. Transfektion von Zellen, die entweder mit dem Lipid-Reagens (Schritt 3.1) oder dem Protein / Polyamin-Reagens (Schritt 3.2).

3. Transfektion

1. Lipid basierende Transfektion:
   1. Aufwärmen der Transfektion reagent, um in der Dunkelheit auf RT. Warm up Serum-freien Medium und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C.
   2. Mit 0,5 ug Plasmid-DNA in 50 ul serumfreiem Medium in einem 1,5-ml-Röhrchen. Add 2 ul Transfektionsreagenz mit der Pipettenspitze unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit. Vortex 6 Sek.
   3. Verlassen das Reagenz / DNA-Mischung im Dunkeln bei RT für 30 min.
   4. Während der 30-minütigen Inkubation, entfernen Sie die Medien aus dem Brunnen und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung.
   5. Nach 30 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS zu dem Reagenz / DNA-Gemisch. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren.
   6. Werden 300 ul des verdünnten Gemisches in jede Vertiefung. Inkubieren für 2-4 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
   7. Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator vor der Zellstimulation.
2. Protein / Polyamin basierende Transfektion:
   1. Warm up Serum-freienmittlere und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C.
   2. Hinzuzufügen 0,75 ul Transfektionsreagenz auf 18,75 & mgr; l serumfreies Medium. Vortex kurz mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 0,5 ul 1 ug / ul DNA in die verdünnte Reagenz transfiziert. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
   3. Während der 10-minütigen Inkubation, entfernen Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung.
   4. Nach 10 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS in das Reagenz / DNA-Gemisch.
   5. Add 270 ul der verdünnten Mischung auf das gut. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator für 2-4 Stunden.
   6. Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.

4. Zellstimulation und Luciferase Assay

1. Tauschen Sie Medien in den gut 250 ul frischem DMEM / 9% FCS.
2. In 50 ul LPS oder LPS + IL-10 In den gewünschten Konzentrationen zu der Bohrung. Gibt die Platte an die 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator. Regen Sie für 2 - 6 h.
3. Entfernen Stimulationslösung durch Absaugen, Waschen mit eiskaltem PBS, und fügen Sie 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bei RT für 30 min. Kratzen und übertragen das Lysat auf 1,5-ml-Röhrchen und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
4. Transfer 40 ul geklärtes Lysat (Überstand), um einen weißen, clear bottom Platte mit 96 Vertiefungen für die Bestimmung der Luciferase-Signalen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
5. Lesen Sie das Luciferase-Signal mit einem Luminometer über das gesamte sichtbare Lichtspektrum.

5. Datenanalyse

1. Berechnung der Firefly Renilla Verhältnis durch Dividieren einzelnen Werte von Firefly Luziferase durch die Werte von Renilla-Luciferase aus jeder Vertiefung.
2. Berechnen Sie die fache Änderung durch Division der Glühwürmchen: Renilla Verhältnis der behandelten gutder unbehandelten gut.

Ergebnisse

Figur 1 vergleicht die Transfektionseffizienz der beiden Transfektionsreagenzien in RAW264.7. Das Lipid-Reagens ergab typischerweise etwa 25% Transfektionsrate während das Protein / Polyamin-basierende Transfektion führte zu etwa 5% Wirkungsgrad (1A). Der Unterschied in der Transfektionseffizienz wurde auch in Luciferase Signale in RAW264.7-Zellen mit den pGL3-Promotorreporter IκBζ (1B) transfiziert beobachtet. Zugabe von LPS zu diesen transfizierten Zellen erhöhte...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll nicht allein auf die Transfektionseffizienz zu konzentrieren, sondern zielt darauf ab, einen Ausgleich zwischen Effizienz und Erhaltung der physiologischen Zustände der Zellen zu schlagen. Insbesondere gelingt es unserem Verfahren bei der Minimierung der Toxizität von Transfektionsreagenz und Maximierung der Luciferase-Signal.

Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Gesundheit der Zellen. Wuchert Kulturen nicht geeignet sind für die Transfektion als ihr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910