L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Riepilogo

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Gravidanza è caratterizzata dalla infiltrazione di leucociti nei tessuti riproduttivi e all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis). Questa interfaccia è il sito anatomico di contatto tra materna e tessuti fetali; Pertanto, è un sito immunologica di azione durante la gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale svolgono un ruolo centrale in impianto, manutenzione di gravidanza, e la tempistica di consegna. Pertanto, caratterizzazioni fenotipiche e funzionali di questi leucociti forniranno informazioni sui meccanismi che portano a disturbi della gravidanza. Diversi protocolli sono stati descritti per isolare leucociti infiltranti dai basalis decidua e parietalis decidua; Tuttavia, la mancanza di uniformità nei reagenti, enzimi, e tempi di incubazione rende difficile confrontare questi risultati. Descritto qui è un nuovo approccio che combina l'uso di dolci diss meccanici ed enzimaticitecniche ociation per preservare la vitalità e l'integrità dei marcatori extracellulari e intracellulari nei leucociti isolati dai tessuti umani all'interfaccia materno-fetale. A parte immunofenotipizzazione, coltura cellulare, e lo smistamento delle cellule, le future applicazioni di questo protocollo sono numerose e varie. Seguendo questo protocollo, i leucociti isolati possono essere utilizzati per determinare la metilazione del DNA, l'espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (cioè, fagocitosi, citotossicità, la proliferazione delle cellule T, e plasticità, ecc), e la produzione di specie reattive dell'ossigeno all'interfaccia materno-fetale. Inoltre, utilizzando il protocollo descritto, questo laboratorio è stato in grado di descrivere nuove e rare leucociti all'interfaccia materno-fetale.

Introduzione

La gravidanza è caratterizzato da tre fasi distinte, immunologiche: 1) impianto e placentazione precoce associata ad una risposta pro-infiammatoria (cioè, l'impianto assomiglia un 'ferita aperta'); 2) il secondo trimestre e la maggior parte del terzo trimestre di gravidanza, quando omeostasi immunitaria è ottenuta attraverso uno stato prevalentemente antinfiammatoria all'interfaccia materno-fetale; e 3) il parto, uno stato pro-infiammatorio ^1-7. Le cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta infiammatoria all'interfaccia materno-fetale in cui la loro abbondanza e il cambiamento di localizzazione durante la gravidanza ^6-9.

Negli esseri umani, l'interfaccia materno-fetale rappresenta un'area di contatto diretto tra materna (decidua) e fetale (corion o trofoblasto) tessuti. Questa interfaccia comprende: 1) la decidua parietalis che riveste la cavità uterina non coperto dalla placenta ed è in giustapposizioneal laeve corion; e 2) i basale decidua, che si trova nel piatto basale della placenta dove viene invasa da trophoblasts interstiziali ¹⁰ (Figura 1). L'intimità di queste aree di contatto crea le condizioni per l'esposizione fetale antigenica materno ^11-13 sistema immunitario. Non sorprendentemente, leucociti comprendono fino al 30-40% delle cellule deciduali ^8,9,14,15 in aggiunta alle cellule stromali tipici tipo e cellule ghiandolari ^8,14,16. Il ruolo dei leucociti all'interfaccia materno-fetale comprende più processi che includono la limitazione del trofoblasto dell'invasione ^17, rimodellamento delle arterie spirali ^18,19, mantenimento della tolleranza materno ^12,20, e l'avvio del lavoro ^21-26. Leucociti sia del adattativa e arti innate del sistema immunitario, cioè, le cellule T, macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule dendritiche e cellule NK, sono state identificate nei tessuti deciduali, e loroproporzioni e lo stato di attivazione hanno dimostrato di variare spazialmente e temporalmente durante la gestazione ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbazioni nella popolazione e / o la funzione dei leucociti sono associati con aborto spontaneo ^31, preeclampsia ^32, ritardo di crescita intrauterino ^32,33, e parto pretermine ^7,24. Pertanto, lo studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali di leucociti all'interfaccia materno-fetale umano faciliterà la delucidazione delle vie immunologiche disregolato nei disturbi della gravidanza.

Uno degli strumenti più potenti utilizzati per determinare il fenotipo e proprietà funzionali dei leucociti è citometria a flusso, la tecnologia che consente l'analisi quantitativa di più parametri contemporaneamente ^34-36. Per analizzare leucociti mediante citometria di flusso, è richiesto l'isolamento dei leucociti in una cella singola sospensione. Pertanto, un metodo per separare infiltrazione leukocytes dall'interfaccia materno-fetale è necessario per studiare la loro fenotipiche e funzionali.

Diversi metodi sono stati descritti per isolare leucociti dall'interfaccia materno-fetale umano ^{10,14,25,27,37-39.} Mentre alcuni si applicano disaggregazione meccanica ^10,25,27,38, altri usano digestione enzimatica ^37,40 per la dissociazione dei tessuti. Perché disaggregazione meccanica produce una resa inferiore e ridotto la vitalità ^41, e la dissociazione enzimatica può influenzare la vitalità e superficie cellulare marcatore ritenzione ^42, il metodo qui descritto combina dolce dissociazione meccanica con enzimatica pretrattamento per aumentare la resa dei leucociti isolati, senza compromettere la vitalità cellulare. Una simile combinazione di metodi è stato dimostrato per essere efficace nell'isolamento dei leucociti dai tessuti deciduali all'interfaccia materno-fetale ^39. Pertanto, il protocollo qui descritto comporta mechadisaggregazione nica con un dissociatore tessuto automatico che aumenta la coerenza risparmiando tempo e fatica rispetto a macinazione tradizionale con bisturi contrapposti, lame di rasoio o forbici chirurgiche ^10,28. L'enzima scelto per la dissociazione dei tessuti era Accutase. A differenza di uso comune collagenasi ^43, dispasi ^44, e ⁴⁵ tripsina, Accutase (una soluzione distacco cellulare) combina proteolitici generale e le attività che contribuiscono al collagenolitica efficiente dissociazione ma delicato ^46,47. Dopo la dissociazione, i leucociti sono arricchiti dalla popolazione totale delle cellule deciduali di gradiente di densità centrifugazione. Vari mezzi gradiente di densità sono stati precedentemente utilizzati, il più comune dei quali sono Percoll (una sospensione di particelle di silice colloidale) ⁴⁸ e Ficoll (un polimero di saccarosio con un elevato peso molecolare sintetica) ^49. L'efficienza superiore di isolamento dal polimero saccarosio è stata previously mostrato ^50, e il protocollo descritto qui ulteriormente dimostra che questo supporto gradiente di densità produce una sufficientemente elevata purezza dei leucociti mononucleari.

Pertanto, il protocollo qui descritto combina la disaggregazione tessuto meccanico con dissociatore automatica tessuto, la digestione enzimatica con una soluzione distacco cellulare, e la separazione dei leucociti con un supporto gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) per isolare leucociti da tessuti deciduali umani. Questo protocollo è stato dimostrato per preservare antigeni di superficie cellulare con la vitalità cellulare. I leucociti isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni che includono immunofenotipizzazione con citometria di flusso e studi funzionali in vitro.

Protocollo

Questo protocollo è appropriato per leucociti isolamento dai basalis decidua e parietalis decidua in preparazione per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Inoltre, le cellule isolate possono essere utilizzati per la separazione delle cellule, colture cellulari, isolamento dell'RNA, e citologia. Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica umana deve essere ottenuto dal Research Comitato Etico Locale e Institutional Review Boards. La raccolta e l'utilizzazione di campioni umani a fini di ricerca sono state approvate dai Institutional Review Board dell'Istituto Nazionale Eunice Kennedy Shriver delle saluti infantili e dello sviluppo umano (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Dipartimento di Salute e Servizi Umani (DHHS , Bethesda, MD, USA) e Wayne State University (Detroit, MI, USA). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutte le donne incinte prima della raccolta di campioni di tessuto.
NOTA: Mentre si lavora con sangue animale, cellule o di pericoloAgenti OU come indicato in questo protocollo, è fondamentale che una corretta biosicurezza e le azioni di sicurezza di laboratorio essere seguite.

1. La dissezione dei tessuti umani deciduali

NOTA: La piastra basale è la base sottostante e attaccato alla placenta e rappresenta la superficie materno. Le membrane chorioamniotic comprendono sacco amniotico e il corion. La piastra basale comprende i basale decidua e il corion include i parietalis decidua (Figura 1).

1. Decidua Basalis
   1. Sezionare un pezzo della piastra basale da un cotiledone della placenta (Figure 1A e 1B).
   2. Mettere su un tagliere sterile con i villi placentari rivolti verso l'alto. Il lato mostrando la villi della placenta è di solito rosso sanguinante con il tessuto peloso in apparenza. La piastra basale è liscia e pallida di colore rosso.
   3. Utilizzare taglienti, forbici a punta fine e pinze per rimuovere il villtessuti e vasi sanguigni unità organizzative. Mantenere il tessuto imbevuto di 1x PBS (Ca ²⁺ - e Mg ²⁺ - libera) durante il processo (Figura 1C). Raccogliere 2-3 di questi pezzi e risciacquare accuratamente con 1x PBS per rimuovere il sangue (Figura 1D).
2. Decidua parietalis
   1. Sezionare un pezzo di membrane chorioamniotic (circa 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Mettere sul tabellone con il corion rivolto verso l'alto. Il lato corionica contiene coaguli di sangue e di solito è giallo chiaro a colori.
   2. Utilizzare pinze a punta fine per rimuovere il maggior numero di coaguli di sangue il più possibile (Figura 1E). Sciacquare la membrana in sterili 1x PBS per pulire il sangue in eccesso dalla membrana fino a quando la 1x PBS è pulita.
   3. Utilizzare un raschietto cellulare usa e getta sterili per raschiare delicatamente lo strato deciduali dalla membrana. Applicare sterile 1x PBS sul membrane mentre il completamento di questo processo (Figura 1F). Raccogliere i tessuti deciduali e metterli in un tubo di plastica da 50 ml con sterile 1x PBS (Figura 1G).

2. meccanica disaggregazione e digestione enzimatica

1. Lavare il tessuto sezionato dai basale decidua (dal punto 1.1.3) o il parietalis decidua (dal punto 1.2.3) con sterile 1x PBS in un tubo di plastica da 50 ml. Raccogliere pellets tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Aspirare il surnatante che si trova sopra il precipitato di tessuto con attenzione senza disturbare il pellet.
   NOTA: A questo punto, il pellet sono molto allentati perché contengono globuli rossi. Se il volume del pellet è circa o inferiore a 3 ml, risospendere il pellet in 6 ml di soluzione di distacco cellulare pre-riscaldato a 37 ° C. Se il pellet è più grande di 3 ml di volume, aggiungere più soluzione distacco cellulare (aggiungere circa 2 volte °e volume dei campioni di tessuto).
3. Trasferire i tessuti omogeneizzati (basale decidua + soluzione o decidua distacco delle cellule parietalis + soluzione distacco cellulare) per un tubo C.
4. Posizionare il tubo C nel dissociatore automatica ed eseguire il programma corrispondente.
   NOTA: Il programma per i basale decidua corre per 17 secondi con 668 colpi totali per correre. Il programma per i parietalis decidua corre per 37 secondi con 235 colpi totali per correre. Questi programmi sono stati personalizzati per isolare leucociti dalle basale decidua oi parietalis decidua con una buona resa e la vitalità cellulare.
5. Dopo la disgregazione meccanica dei tessuti, digerire i tessuti con una soluzione distacco cellulare disponibile in commercio come accutase; (Un cocktail che contiene enzimi proteolitici e collagenolitica) per 45 min a 37 ° C con agitazione.

3. Isolamento di leucociti

1. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di PBS 1x al DigeBustione miscela e farla passare attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo di plastica da 50 ml. A seconda della viscosità della miscela di digestione, uno potrebbe essere necessario utilizzare diversi filtri cellulari per una miscela.
2. Riempire il tubo con 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la PBS 1x sopra i pellet cellulari attentamente e risospendere il pellet con 5 ml di tampone FACS ghiacciato.
   NOTA: per studiare i polimorfonucleati e leucociti mononucleari insieme, andare al passo 6.1; per studiare i leucociti mononucleari, passare alla Fase 3.3.
3. Aggiungere 5 ml di 20% supporti gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) in una provetta di plastica da 15 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima al supporto gradiente di densità. Mentre stratificazione del campione, è importante non mescolare i media gradiente di densità con la sospensione cellulare.
4. Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a 4 ° C, senza il freno. E 'molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e lOsing il gradiente. I leucociti si trovano nell'interfaccia tra il supporto gradiente di densità e il buffer FACS.
5. Rimuovere lo strato superiore che contiene il buffer e cellule detriti FACS molto attentamente con una pipetta. La banda all'interfaccia contiene le cellule mononucleate deciduali e una porzione di leucociti polimorfonucleati.
6. Trasferire le cellule all'interfaccia completamente in un tubo di plastica da 15 ml. Aggiungere almeno 3 volte più volume di tampone FACS.
7. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per pelletizzare cellule. Aspirare il surnatante e lavare le cellule con tampone FACS. Pelletizzare le cellule con un'altra centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Per eseguire la coltura cellulare, vedere il passaggio 4. Per eseguire l'ordinamento delle cellule, vedere il passaggio 5. Per effettuare immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 6.

4. Le domande - Colture cellulari

1. Risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di terreno di coltura RPMI 1640. Contare le cellule vitali using un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%.
2. Aggiungere la quantità di terreno di coltura RPMI per effettuare una concentrazione cellulare di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. Le cellule sono ora pronti per la cultura.

5. Applicazioni - Isolamento dei macrofagi per colture cellulari primarie

1. Per isolare cellule CD14 +, magneticamente etichettare le cellule dal punto 3.7 con microsfere CD14 (20 perline microlitri per 10 ⁷ cellule), incubare per 15 min a 4 ° C, e CD14 + cellule separato da altri tipi di cellule, applicando un campo magnetico. Dopo 2 lavaggi con tampone e la rimozione del campo magnetico MACS, eluire le cellule CD14 + magneticamente a nuovo con tampone MACS.
2. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in RPMI 1640. terreno di coltura le cellule sono pronte per la placcatura (Figura 2).

6. Applicazioni - immunofenotipizzazione

1. Per utilizzare le cellule per immunophenotyping, risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di PBS 1x. Contare le cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%.
2. Etichettare le cellule con un colorante vitalità fissabile (Figura 3). Lavare le cellule due volte con tampone FACS e risospendere le cellule in tampone macchia. Incubare con un bloccante FcR per 15 minuti a 4 ° C.
3. Aggiungere anticorpi coniugati a fluorocromi extracellulari. Ad esempio, in questo protocollo, utilizzare anti-CD3, anticorpi anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabella 1). Incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio.
4. Dopo 2 lavaggi con 1x PBS, le cellule saranno analizzate in 500 ml di buffer di macchia con un citofluorimetro. Una rappresentazione della strategia gating utilizzato per analizzare i leucociti sub-popolazioni presenti nei tessuti deciduali è mostrato in Figura 4.

Risultati

. La dissezione dei tessuti umani all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis) è mostrato in Figura 1 Questa procedura prevede la dissezione della piastra basale, che comprende le basale decidua (Figura 1A - D). Il basalis decidua è ottenuto rimuovendo villi placentare (lato fetale) dalla piastra basale (Figura 1C). Il parietalis decidua viene raccolto raschiando delicatamente la membrana corionica (Figura 1E

Discussione

Caratterizzazione delle proprietà funzionali e fenotipiche di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale umano è essenziale per la comprensione dei meccanismi immunitari che portano a disturbi della gravidanza. Diverse tecniche sono state descritte per isolare leucociti dall'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza umana ^{10,14,25,28,37,42,43.} Tuttavia, ciascuna di queste tecniche è distinta, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator