JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Аннотация

Пределы оптическим разрешением и вызов определения конкретных групп населения белка в просвечивающей электронной микроскопии было препятствий в клеточной биологии. Многие явления не может быть объяснено с помощью анализа ин витро, в упрощенных системах и необходимость дополнительной структурной информации на месте, в частности, в диапазоне от 1 нм до 0,1 мкм, для того, чтобы полностью понять. Здесь электронной спектроскопии изображений, техника микроскопия электрона передачи, который позволяет одновременное отображение распределения белков и нуклеиновых кислот, а тег выражение, miniSOG, объединяются, чтобы изучить структуру и организацию ДНК двухцепочечной ремонта перерыв очагов.

Введение

Несмотря на значительные достижения в световой микроскопии за последние годы 1, сотовые биологи до сих пор страдают от разрыва в резолюции. Это ограничивает понимание структурно-функциональных отношений в основных клеточных процессах, которые связаны согласованное взаимодействие между макромолекулярных комплексов (например, в хроматина, репарации ДНК, транскрипции РНК и ДНК) репликации. Хотя электронные микроскопы передачи (ТЕА) S обеспечивает требуемое разрешение, он был сложным определить эти процессы структурно из-за невозможности обозначения специфических белков в то же время быть в состоянии определить биохимический состав визуализированных структур. В отсутствие внутренних мембран, чтобы помочь дифференцировать ядерные структуры, ядро ​​было особенно сложным. Электронной спектроскопии томография (ESI) решает некоторые из этих ограничений, позволяя одновременно регистрировать и дифференцировку ДНК, РНК и протЭйн-основе ядерных структур 2-5.

Электронной спектроскопии изображений:

Для отображения элементарных распределений при высокой чувствительности и разрешения в электронном микроскопе, можно использовать изображения спектрометр, который выбирает электроны, которые были неупругорассеянных через взаимодействие с внутренними электронами оболочки элемента в образце 6. Из-за специфичной для элемента количества энергии теряется вследствие ионизации атомов в образце, эти электроны могут быть разделены и визуализированы с помощью спектрометра, который прикреплен к электронным микроскопом. Таким образом, анализ спектра электронов, взаимодействовали с образца показывает качественную и количественную информацию о химическом составе образца 7. Электроны, которые не теряют энергию при прохождении через образец можно найти в "пик нулевых потерь" потери энергии электроновспектра. Избыток этих электронов связано с массовой плотностью, и толщины образца и состоит из электронов, проходящих через образец, не сталкиваясь с образцом или потери энергии при прохождении через образец. Эта информация может быть полезна для количественного определения абсолютного числа атомов определенного элемента настоящее в образце 8.

Так биологические образцы состоят главным образом из легких элементов, которые плохо отклонить электроны в падающем пучке ТЕА окрашивание методов с использованием соли тяжелых металлов должны быть применены для того, чтобы генерировать контраст в образце. Отсутствие специфичности большинства этих контрастных агентов и неспособности визуализировать более одного пятна, где специфичность можно ограничивает величину обычной электронной микроскопии при исследовании ядра. ESI имеет значительные преимущества по сравнению с обычными ТЭМ, в частности, для изучения структур клеточного ядра.Можно использовать фосфора богатых природу ДНК- и РНК-содержащих макромолекулярных комплексов, чтобы отличить нуклеопротеидных комплексов из белковых комплексов и решить различные нуклеопротеидных комплексы на основе их плотности нуклеиновых кислот. Остальные биологический материал могут быть отображены на основе его избытке азота. Сопоставление только этих двух элементов и анализ их распределения и относительной численности в рамках различных анатомических структур дает нам много информации о ядре. Например, это легко определить хроматин и рибосом в карте, представляющих изобилие фосфора. Интерхроматиновых пространство, ядерные поровые комплексы, и ядерные тельца, с другой стороны, могут быть легко обнаружены в карте азота изображения.

Мини система синглет генератор кислорода (miniSOG)

В то время как ESI представляет собой мощную технику для изучения на месте структуры хроматина, потому что это займетс преимуществом характерных показателей в элементного состава между фосфором и азотом, элементный состав обычно не могут быть использованы для различения разных популяций белковых комплексов. Антител, меченных с мелкими частицами золота в нанометровом диапазоне были широко используется для отображения местоположения отдельных молекул. Поскольку частиц золота, как правило, прилагается к вторичным антителом, оно появится в окружности примерно 20 нм вокруг эпитопа, обнаруженного с первичным антителом. В пост-вложение образцов, антитела могут обнаруживать только эпитопы, которые подвергаются на поверхности секций. В то время как это можно доказать наличие антигена и связать его с определенной анатомической структуры клетки, в информацию, полученную является неполной, так как большинство из эпитопов затемняется смолы. Предварительно вложение методы, которые используют протоколы подобные тем, которые используются для флуоресцентной микроскопии, разрешить доступ к антигенам всейна всю глубину образца, но шаги проницаемости, которые необходимы, чтобы позволить антителу проникают в клетку, как правило, требуют удаления липидные мембраны и удаления компонентов, которые не могут быть решены путем альдегидов. Кроме того, предпочтительным альдегидом фиксатор для сохранения ультраструктуру, глутаральдегида, обычно уничтожает эпитопы и, следовательно, параформальдегид, как правило, требуется. Это менее эффективно белок-белкового сшивки. Другим недостатком антител, которые помечены наночастиц золота в том, что золото является очень электронно-плотного материала, что создает резкий контраст, который может затенить интересные конструктивные детали образца, который имеет слабую контрастность.

Появление зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве выраженной тега белка превратил использование флуоресцентной микроскопии, чтобы ответить на вопросы в клеточной биологии. Пометка белок с небольшим флуоресцентного домена позволяет отображение его распределения в естественных условиях без необходимости процедуры проницаемости, которые могут изменить структуру. Для того, чтобы перевести элегантный принцип использования белковых теги для отображения распределения белка в клетке электронной микроскопией, система была необходима, что способна производить сигнал близка к структуре интересов и создания контраста в ПЭМ. Полимеризованный диаминобензидин это пятно, которое часто используется в гистологии, чтобы обнаружить антитела обязательными. Этот краситель, как правило, наносят при помощи пероксидазы хрена (HRP), конъюгированный с вторичным антителом. Хотя реакция производит надежный результат, ПХ не каталитически активным в цитозоле клеток 9. Продукты реакции HRP может также диффундировать от места производства таким образом, чтобы их разрешение хуже, чем методом нанозолотом 10. Для того, чтобы обойти эти проблемы, флэш-система / ReAsH был разработан 11. Он состоит из рекомбинантных слитых белков, которые обладают tetracysteine ​​мотив. Этот мотив позволяет связываниеbiarsenic флюорофор. При возбуждении, связанный со вспышкой или ReAsH способен генерировать активные формы кислорода весьма синглетный и, таким образом, photoconvert диаминобензидина (DAB) в полимер, который выпадает в осадок сразу на месте меченых белков. Полимер DAB могут быть окрашены осмия, который электронно плотной и, таким образом, может быть использован для отображения распределение рекомбинантного слитого белка в ПЭМ.

В 2011 году Shu др. 10 представлены системы miniSOG, который состоит из небольшого 106 аминокислот слитого тега, полученной из флавопротеида из Arabidopsis, который флуоресцентные и способны создать много радикалов синглетный кислород при возбуждении 448 нм синим светом. Эти синглетных кислородные радикалы могут быть использованы для фото-окисления диаминобензидино с образованием полимеров на и вблизи поверхности меченый белок, который значительно ближе, чем immunogold меченых антител 11. В то время как система Flash / ReAsH требует чего фторхром и диаминобензидин в клетки, прежде чем делать фотоконверсии, система требует только miniSOG диаминобензидина и свет, и в дополнение примерно так эффективны дважды полимеризации диаминобензидина. Здесь miniSOG используется в сочетании с ESI с целью картирования ультраструктуры репарации ДНК фокусов.

Репарации ДНК очаги (ФПИ)

Неотремонтированного ДНК двойные разрывы ДНК представляют собой серьезную угрозу для клетки, так как они могут привести к потере транслокаций и генетической информации. В свою очередь, это может привести к старения, рака и смерти клеток. Многие белки, участвующие в ДНК двойной ремонта прядь перерыв накапливаются в очагах, что собрать вокруг ДНК двойной нити сломать 12-14. Хотя их функция не известна, они представляют собой сайт в ядре, который содержит ДНК двойной разрыв нити и этот участок ДНК двухцепочечной ремонта разрыва.

Репарации ДНК ВОКя (ФПИ) были охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии, и они служат в качестве биомаркеров для повреждения ДНК 12,15. Они массивны по сравнению с размером двухцепочечной перерыва и считались относительно однородным до недавнего микроскопия сверхвысокого разрешения не показали некоторые признаки суб-компартментализацией молекул внутри каждого рынка 16. Для того, чтобы понять, как эти сайты организованы, необходимо визуализировать все исходные биологических структур относительно друг друга. Это не может быть достигнуто с помощью флуоресцентной микроскопии, но возможно через электронную микроскопию 17,18. Здесь описан способ, который сочетает спектроскопического изображений электронов с методом miniSOG, чтобы проиллюстрировать потенциал Этот комбинированный подход, чтобы исследовать ультраструктуру репарации двухцепочечной перерыва.

протокол

1. Генерация miniSOG клеточных линий

  1. Выращивают U2OS (остеосаркомы человека) клетки в 35 мм чашку, содержащую 2 мл низкий уровень глюкозы в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), который с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 Атмосфера.
  2. Трансфекции клеток, когда они 80% сливной липофекцией с очищенной качества трансфекции (A269 / 280 Коэффициент 1,8-2,0) плазмидные конструкции, содержащие последовательности для miniSOG и mCherry меченых белков ремонт в соответствии с протоколом производителя реагента для трансфекции 19. Выражение плазмиды miniSOG можно заказать в Цяня-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. Сортировать клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок с тегом miniSOG и mCherry флуоресцентной активированный сортировки клеток двух дней после трансфекции. Сбор клетокс промежуточной интенсивности флуоресценции во избежание клетки, которые с гиперэкспрессией 20.
  4. Культура положительных клеток на 10 см чашку в 10 мл DMEM среде, которая с добавлением 10% FBS и 0,6 мкг / мл G418 селективного агента (Geneticin).
  5. После видимые колонии появились на пластинах, экран для mCherry положительных колоний с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа и рисовать круги вокруг них (на нижней части пластины) с маркером. Используйте малом увеличении воздуха объектива (например, 10x) и выбрать клонов с использованием стерильной техники, тщательно царапин колонии от и медленно сосать их в стерильной 1000 мкл кончика пипетки.
  6. Expand отобранные колонии и заморозить их части вниз с помощью питательной среды, описанные в шаге 1.1, дополненной 10% диметилсульфоксида. Проверьте клетки для формирования ФПИ путем выращивания их на стерильных 18 х 18 мм 2 покровные стекла и подвергая их2 Гр излучения. Облученные клетки стабильно экспрессирующие miniSOG mCherry помечены ремонт белок должен показать типичный образец фокусное характеристику ДР, когда визуализируется с помощью флуоресцентного микроскопа фильтр-набор для визуализации mCherry.

2. Культура клеток

  1. Культура U2OS клетки стабильно выражения miniSOG и mCherry помечены ремонт белки в условиях, изложенных в пункте 1.1. Рост клеток до 80% слияния в 35 мм Диаметр стеклянным дном чашке, содержащей 2 мл DMEM. Убедитесь, что клей, который придает покровное к пластику и используемого пластика устойчив к водных и спиртовых растворов и устойчив к используемой смолы!
  2. Перед проведением эксперимента, наметить небольшую площадь около 1 мм 2, который содержит клетки, экспрессирующие эктопические белки от царапин с помощью стерильного алмазной ручкой с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы определить область интереса. Можно также использовать стекло снизу блюдо тшляпа содержит покровное с заранее протравленной системы сетки, построенной в покровное.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании высокого качества корреляционный микроскопии сочетая ESI и флуоресценции микроскопических фотографий: 21, убедитесь, что толщина покровного стекла совместима с целями масло погружения. Следует иметь толщину No. 1.5 (0.16-0.18 мм). Выберите область, недалеко от центра тарелки для региона рассмотрены в ТЕА во избежание проблем с полимеризации смолы, которые могут возникнуть у краев (см пункт 4.10-4.13).

3. Повреждения ДНК Индукция

  1. Облучать клетки с гамма-излучением, использовать радиомиметических препарат, или индуцировать повреждение под действием лазерного излучения на микро конфокальной микроскопии (например, как описано в 18,22 или 23).
  2. В этом примере, облучать клетки с 2 до 6 Гр гамма-облучением в цезий-137 источника излучения или лазерного microirradiate использованием 405 нм зольтвердотельного лазера идентификатор конфокальной микроскопии после сенсибилизации клеток в течение 20 мин с 0,5 мкг / мл Hoechst.

4. Подготовка проб

  1. Зафиксировать клетки с 1 мл 4% параформальдегида в буфер ОСТОРОЖНО какодилатном 0,1 М натрий или в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид и какодилат натрия токсичны! Надевайте перчатки и распоряжаться токсичных веществ адекватно.
  2. Промыть клетки дважды 4 мл буфера рН какодилат 0,1 М натрий 7,4 или фосфатного буфера, рН 7,4.
  3. Treat фиксированные клетки с 2 мл 50 мМ глицина, 5 мМ аминотриазол и 10 мМ цианид калия осторожностью в буфере какодилатном 0,1 М натрий или 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) (проверить рН!) В течение 30 мин для того, чтобы блокировать непрореагировавший альдегидные группы и подавить активные формы кислорода, генерируемых гема групп, которые могут увеличить фон.
    ВНИМАНИЕ: Калий цианистый является чрезвычайно токсичным! Втуха, перчатки, работать под капюшоном и распоряжаться токсичных веществ адекватно. Реакция очень чувствительны к рН, поэтому важно, чтобы рН проверены и точны.
  4. Запишите площадь, которая была выбрана в шаге 2.2 в 2D или 3D на перевернутой флуоресцентного микроскопа, если корреляционная микроскопия желательно.
  5. Подготовка 1 мг / мл раствора гидрохлорида диаминобензидина ВНИМАНИЕ путем размещения 10 мг гидрохлорида диаминобензидина планшет в 2 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 980 мкл дистиллированной H 2 O и 20 мкл концентрированной соляной кислоты (11,65 м) и перемешать до тех пор, пока раствор не станет светло-коричневого и прозрачным. Развести этот раствор в 0,1 М фосфатном или 0,1 буфере какодилатном М натрий до конечной концентрации 1 мг / мл, а доведение рН гидроксидом натрия до рН от 7,0 до 7,6 (рН 7,4 рекомендуется).
    ВНИМАНИЕ: диаминобензидин токсичен! Надевайте перчатки и распоряжаться токсичных веществ адекватно.
  6. Для фотоокисления, гeplace буфер с 2 мл 1 мг / мл раствора гидрохлорида диаминобензидина в буфере 0,1 М какодилата натрия или фосфатным буфером. Защита это решение от света и охладить его на льду до 4 ° С для того, чтобы увеличить растворимость кислорода. Насыщения раствора кислородом барботированием кислорода через раствор (использовать шланг, который вставляется в раствор и соединенный с бутылкой кислорода). Проверьте рН снова и при необходимости отрегулируйте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для реакции фотоокисления, что рН находится между рН 7,0 и рН 7,6.
  7. Установите блюдо с фиксированными клетками тщательно на перевернутой флуоресцентного микроскопа, снабженного 40x иммерсионным объектива и переместить его в интересующей области. Excite тег miniSOG с синим светом с помощью кубиков фильтра для GFP или CFP. MiniSOG имеет максимум возбуждения при 448 нм с плечом при 473 нм 10.
  8. Продолжить с подсветкой даже после зеленой флуоресценции miniSOG гаS полностью исчезли и до коричневого фото-продукт окисления полимеризованном диаминобензидина возникает в проходящем свете канала. Когда продукт окисления видна в большинстве клеток, выключите освещение флуоресценции, чтобы остановить фото-окисления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фото-окисление может занять до нескольких минут в зависимости от объектива, длин волн передачи фильтра и эффективности, и источником освещения.
  9. Постфикс клетки с 1 мл 2% глутарового альдегида в 0,1 рН какодилатном М натрий 7,4 буферных или фосфатный буфер с рН 7,4 в течение 30 мин.
  10. Закрепить мембраны клеток с 0,1% -0,5% осмия в течение 20 мин в какодилатном буфере, рН 0,1 М натрий 7,4 или в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4.
    Примечание: Рекомендуется использовать минимально возможную концентрацию осмия, необходимого для стабилизации мембран. Так полимеризованные осадки DAB имеют высокую плотность азота, который может быть обнаружен непосредственно ESI, сильныйОкрашивание осмий не нужно определить miniSOG-меченый белок в и может быть пагубным для ESI. Осмий осмия очень токсичен! Работа в вытяжном шкафу и распоряжаться токсичных отходов адекватно.
  11. Высушить, клетки через серию этанола с использованием 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% этанола шаги (каждая 5 мин). Впоследствии, инкубировать клеток в соотношении 1: 1 смеси 100% этанола и акриловой смолы (LR White) и поставить блюдо на шейкере в течение 4 ч, чтобы облегчить проникновение в клетки, прежде чем инкубации клеток в течение по крайней мере еще 4 ч в 100 % акриловой смолы (LR белый).
  12. Для того, чтобы полимеризации смолы, отрезать крышку меченого 2 мл микроцентрифужных трубки с лезвием и пальто обода с ускорителя акриловой смолы. Убедитесь, что ускоритель охватывает только обод и не впадают в трубы. Впоследствии, внимательно заполните трубку примерно две трети с LR Белый смолы с помощью пипетки Пастера. Позаботьтесь, чтобы смола не войти в контакт остроумиемч ускоритель на ободе!
  13. Удаления смолы, которые проникли в клетки в чашке и поместите блюдо вверх дном на вертикальной трубе стоячей микроцентрифужных таким образом, что ширина трубы почти полностью заполняет стекло, покрытое наблюдения окно тарелки.
  14. Подождите 1 до 2 мин в течение ускорителя для герметизации трубки и покровное, затем инвертировать трубку таким образом, чтобы смола в трубе теперь покрывает клетки.
  15. Поместите блюдо с трубкой в ​​печи при 60 ° C и вылечить его в течение 12 часов.
  16. Когда блок вылечить, удалить блюдо с прилагаемой смолы заполненные трубки микроцентрифужных из духовки и отделить микроцентрифужную трубку от тарелки. Содействие разделение по циклов замораживания-оттаивания в жидком азоте и горячей воды.
  17. Отменить стеклянным дном тарелку и тщательно разрезать микроцентрифужную пробирку с лезвием бритвы, чтобы удалить блок.
  18. Добавьте блок с маркером.
  19. Используйте лезвие в третьем блок так, чтобы ничего, кроме 1 мм 2 области, которая содержит область, ранее отмеченные алмазной или вольфрама пера (или содержит область с клетками интересов) не остается.
  20. Установите блок в ультрамикротоме, отделка блок с обрезки ножом и вырезать ультра-тонкие слои примерно 50 нм с использованием алмазного ножа.
  21. Возьмите разделы по высокой передачи 300 сетчатых решеток. Эти сетки имеют очень маленькие бары сетки и, таким образом покрыть меньше клеток в интересующей области.
  22. Пальто разделы на сетках с о 0,2-0,4 нм углерода с использованием углерода для нанесения покрытий, чтобы помочь стабилизировать их под электронным пучком ТЕА.

5. Электронная микроскопия

  1. Загрузите сетки в ПЭМ, который оснащен энергетической фильтра. После настройки микроскопа и энергии фильтр в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, проверять клетки на участках в режиме низкой кратности (нормальная передача) и сравнитеих флуоресценции данных при необходимости (полученный на стадии 4.4).
  2. После того, как ядра с интересными особенностями (повреждения ДНК или ДНК трек ремонт очагов) найдено, переключатель в режим фильтрации энергии и записать толщину карту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура включает в себя запись нулевого потерь и нефильтрованного изображения. Толщиной до 0,3 длины свободного пробега (30% электронов падающего пучка рассеивается образцом) достаточно тонким, чтобы генерировать хорошие элементарные карты.
  3. Соотношение Запись карты фосфора элементов и азота с помощью программного обеспечения, который управляет энергетической фильтр микроскопа, используемого. Запишите на карте фосфора после край изображения на 175 эВ потери энергии с шириной щели 20 эВ и предкраевого изображений при 120 эВ потери энергии, а также с шириной щели 20 эВ. Для карт азота, запись после краевых изображений в 447 эВ при ширине щели 35 эВ и предкраевого изображений в 358 эВ, а также с шириной щели 35 эВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку содержание отображаемого элементов (phosphOrus и азота) является относительно низким (прибл. 1%), выберите "Формат кадра" (качественный элементный карту) по "методу 3 окна" (количественного элементного карту) для того, чтобы генерировать изображения с более сигнала к шуму.

Обработка изображения 6.

  1. Откройте элементные карты соотношение в программное обеспечение для обработки изображений, которые могут обрабатывать формат файла приобретенных изображений (например, цифровой микрофотографии). Скопируйте карту азота в красном канале и фосфора в карте зеленом канале образа RGB, то наложить и выровнять карты.
  2. Экспорт составное изображение в виде файла размеченный формат файла изображения (TIFF). Откройте изображение в программное обеспечение для обработки изображений, которые могут использовать слои (например, Photoshop).
  3. Настройка динамического диапазона каждого канала путем масштабирования минимальных и максимальных значений в изображении, чтобы 8-битом (от 0 до 255) данных.
  4. Вычтите содержание фосфора с карты азота (используяОкно "Слои"), чтобы генерировать качественный карту, которая показывает распределение белка.
  5. Преобразование карты нуклеиновой кислоты (фосфора) и белка (азота), созданный на предыдущем шаге в "индексированные цвета" и создать желтый таблицы поиска в CMYK цвета пространства для карты, показывающей распределение нуклеиновой кислоты и стол голубой подстановки показать без нуклеопротеидную карту. Цвета выбраны, чтобы генерировать максимальную контрастность между двумя элементарных карт.
  6. Создайте новое изображение и импортировать карты, показывающие распределения фосфора и белка в разных слоях. Используйте "экран" режим прозрачности для того, чтобы увидеть как слои накладываются друг на друга.
  7. Откройте изображение с нулевым потери, полученной на этапе 5.2. Это изображение представляет собой изображение записанной области, который выглядит как обычный ТЕМ изображение, но содержит только электроны, которые прошли через образец, не сталкиваясь с образцом. Экспортэто изображение как TIFF изображения.
  8. Откройте экспортированный нулю потери изображения в графическом редакторе и скопировать его в верхнем слое изображение, показывающее элементарную карту. Совместите изображение с помощью "Экран" режим прозрачности.
  9. При желании пороговое изображение нулевой потери сегмента сигнала, который происходит от miniSOG. Добавить полученное изображение как отдельный слой, как описано выше.

Результаты

ESI

Сравнивая изображения УНИ ядра (рисунок 1) с обычными ТЭМ изображений (например, 7-1) показывает резкое увеличение анатомических структур, которые могут быть легко отличить. Хроматиновые хребты появляются в желтый и это довольно легко оп...

Обсуждение

ESI может служить отличным инструментом для изучения различных состояний хроматина и рибонуклеопротеинов в ядре, потому что он способен специфически карту области, которые богаты фосфором. Это глубоко увеличивает количество деталей, которые могут быть получены с помощью электронного ...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishesMatTekP35G-2-14-CGRD not made for immersion objectives
LR White: acryl resinemsdiasum14381
LR White acceleratoremsdiasum14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tabletsSigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
Tungsten-Point Lab Penemsdiasum41148
Osmium Tetroxideemsdiasum19100
Carbon Coater 208 carbonCressington
Ultra microtome Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobemight even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30Gatanmight even work with older versions
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1" (J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJiopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubesFisherbrand05-408-146
Diamond Knife ultra 35°Diatome
Trimming Knife ultratrimDiatome
Sodium cacodylate trihydrateemsdiasum12300Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%emsdiasum16020Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasicemsdiasum21180
Sodium phosphate monobasicemsdiasum21190
Paraformaldehydeemsdiasum19202
Osmium tetroxide 4% solutionemsdiasum19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200MZeiss
Hydrochloric AcidFisherbrandA142-212
Sodium Hydroxide Solution 10MFluka72068
OxygenMedigas
3-Amino-1,2,4-triazoleSigmaA8056
Potassium cyanideSigma207810Caution Toxic!
Ethanolemsdiasum15058Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steelemsdiasum71960Caution Sharp!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
Transmission Electron Microscope 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Energy filterGatan

Ссылки

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. . Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, 308-322 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

103ESIminiSOG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены