マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

要約

我々は、マウスの耳と尾から初代線維芽細胞を生成するための簡単​​かつ迅速に実験手順を説明します。手順は、特別の動物の訓練を必要とせず、最大10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞培養物の生成のために使用することができます。

要約

初代細胞は、組織から直接誘導され、確立された細胞株よりも、インビボでの細胞の生理学的状態をより代表すると考えられています。しかし、初代細胞培養は通常、有限の寿命を有しており、頻繁に再確立される必要があります。線維芽細胞は、初代​​細胞の容易にアクセス可能な供給源です。ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するための簡単​​かつ迅速な実験手順を説明します。プロトコルは、最大10日間室温で保存された耳からの一次線維芽細胞培養物を確立するために使用することができます。プロトコルを注意深く続く場合、汚染は、場合によっては長時間保存された非滅菌組織を使用しても発生しにくいです。線維芽細胞は、培養液中で急速に増殖し、複製老化を受ける前に、かなりの数に拡張することができます。

概要

初代細胞は 、in vitro条件下で組織培養を生きから誘導されます。それは一般的に一次細胞は、より密接に生理学的状態、それらが不死化より由来する組織または腫瘍細胞株¹の遺伝的背景に似ていることが想定されます。そのため、一次細胞は、生物学的な質問の^{2,3を研究するための}有用なモデルを表します。しかし、無制限に成長する樹立細胞株とは異なり、一次細胞培養物は、最終的に老化を受け、頻繁に再確立される必要があります。

一般的に使用される一次細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、T細胞、B細胞、骨髄由来マクロファージ（BMDM）及び骨髄由来樹状細胞（BMDC）を含みます。線維芽細胞は、多くの場合、一次細胞培養モデルとして利用されます。彼らは、他の一次細胞を超える重要な利点を提供します。細胞培養物は、簡単に容易に維持し、設立され、何のpurificaを必要とされていません培養前の細胞の化。彼らは、迅速な初期の増殖および特殊な媒体や活性化のプロトコルのための要件が​​あります。線維芽細胞は、効率的に^4,5、生物学的、化学的、および物理的なプロトコルを使用してトランスフェクトすることができます。細胞培養を確立する前に、室温で最大10日間の耳を格納する可能性があります。線維芽細胞培養物は、細胞質プロセスの可視化に資すると人工多能性幹（iPS）細胞⁶に再プログラミングするのに適しています。

線維芽細胞は、コラーゲンタンパク質及び細胞外マトリックス^{7を分泌する}結合組織の重要な細胞です。彼らは多くの組織⁸の構造フレームワークを提供し、創傷治癒および組織修復^9,10において重要な役割を果たしています。

ここでは、マウス¹¹の耳と尾から線維芽細胞培養物を確立するための簡単かつ迅速（<4時間）プロトコルを記述します。プロトコルは、最小限のマウスが必要です経験は、（他のプロトコル^12,13とは対照的に）組織を採取し、最大10日間室温で媒体に記憶された耳からの培養物を確立するために使用することができます。

プロトコル

マウスを安楽死（シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインおよび実験動物研究のための国家諮問委員会（NACLAR）ガイドライン）まで機関のガイドラインに準拠して無菌状態で飼育しました。

1.マウス

1. 適切な遺伝的背景の一つにマウスを注文。このプロトコルは、1つのC57BL / 6マウス由来の組織に基づいています。

完全培地の調製

1. 10％ウシ胎児血清（FCS）、50μM2-メルカプトエタノール、100μMのアスパラギン、2mMグルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液：ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地に、以下の成分を添加することによって、完全培地を調製します。

酵素液の調製

1. 15ミリリットルコニカルチューブ中のコラゲナーゼD溶液を調製します。
   1. コラゲナーゼD・ディ10mgを秤量4ミリリットルでssolveコラゲナーゼD完全培地。
2. 1.7ミリリットルのマイクロチューブにプロナーゼ溶液を調製します。
   1. プロナーゼ10mgを秤量します。
   2. 1Mトリス緩衝液（pH8.0）の5μLを追加します。 0.5 M EDTA（pH8.0）を1μLを加えます。
   3. 滅菌水494μlのアップトップ。
   4. 30分間、水浴中で37℃でのプロナーゼ溶液をインキュベートします。

コラゲナーゼD-プロナーゼミックスの4準備（≤2尾）

注：無菌細胞培養フード内の後続の手順を実行します。

1. コラゲナーゼDの溶液4mlにプロナーゼ溶液の250μlのを追加します。
2. 滅菌15ミリリットルコニカルチューブに0.2μmのシリンジフィルターを通してコラゲナーゼD-プロナーゼ混合物を渡します。

耳としっぽ組織からの線維芽細胞の5抽出

1. 適切な機関のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
2. 細胞培養フード内でオートクレーブ処理手術器具（ハサミやピンセット）を配置します。
3. 2つの10センチ細胞培養皿それぞれに10ミリリットルを完全培地を追加します。
4. 耳（〜1cmの半径）とはさみでマウスの（尾の先端から）尾の5センチカットし、滅菌50mlコニカル底チューブに40ミリリットルの70％エタノールで5分間インキュベートします。
5. 空気乾燥耳と尻尾5分間フード内で開いた10cmの細胞培養皿に置くこともできます。ステップ5.3で説明したように10ミリリットルを完全培地を含む「耳」と「テール」と表示された2つの培養皿に乾燥後、転送耳と尾の部分。
6. はさみを使用して、耳と尻尾から髪を削除します。
7. はさみを使用して、サイ​​ズが3ミリメートル未満の片に耳と尻尾を切ります。
8. 「耳」と「テール」と表示された1.8ミリリットルクライオチューブバイアルにカット組織を移し、バイアルに1.8ミリリットルのマークに到達するために、ボリュームのために十分なコラゲナーゼD-プロナーゼ溶液を添加。
9. Pシェーカー上で水平にクライオチューブバイアルレース、37℃で90分間、200rpmでサンプルを振ります。
10. 90分間のインキュベーション後、シェーカーからクライオチューブバイアルを削除し、フード内でバイアルを配置します。
11. 2つの10センチ細胞培養皿、標識された「耳」と「テール」それぞれに10ミリリットルを完全培地を追加し、各皿に70μmのセルストレーナーを置きます。
12. ステップ5.11で製造さに応じてラベル皿に70μmのセルストレーナーで消化耳と尾の組織を置き、強制的に> 5分間10mLのシリンジプランジャーを使用して組織を挽きます。セルストレーナーの外に細胞を洗浄するために培地中で時折セルストレーナーを振ります。
13. 「耳」と「テール」というラベルの付いた2つの15ミリリットルコニカルチューブに各皿から細胞懸濁液をピペット。さらに10 mlの一品とストレーナーを洗浄し、完全培地および適切な15ミリリットルコニカルチューブに培地を追加します。
14. 細胞をスピンダウン〜580 XGと冷蔵細胞遠心機を用いて4℃で7分間のサスペンション。
15. 上清を除去し、15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞ペレットに完全培地10ミリリットルを加えて細胞を懸濁します。
16. 繰り返しステップ5.14と5.15。

細胞混合物の6培養

1. 上清を取り除きます。細胞ペレットを邪魔されずに残っていることを確認してください。
2. 10ml中の細胞完全培地を再懸濁し、「耳」と「テール」というラベルの付いた2つの10センチメートル細胞培養皿に、それぞれの混合物を追加します。
3. 培養液に10μlのアムホテリシンB溶液（250 / mlのストック溶液）を追加します。
4. 加湿した5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。
5. 三日目に、10 mlの破片（ 図1および2）を除去するために、アムホテリシンBの10μLを含む新鮮な完全培地を培地を交換してください。

線維芽細胞の7サブカルチャー

1. WHEn個の培養物は、約70％コンフルエンシー（日培養の3-4）培地を除去し、5 mlの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄するに至ります。
2. PBSを削除し、セルに2ミリリットルの滅菌1×トリプシン-EDTA溶液を加えます。
3. 加湿した5％CO ₂インキュベーター中、37℃で5分間、細胞をインキュベートします。
4. 5分後、静かに培養皿をタップし、細胞に6ミリリットルを完全培地を追加します。
5. 15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、冷蔵細胞遠心機を使用して〜450×gで、4℃で5分間チューブをスピン。
6. 上清を除去し、静かに5ミリリットルの完全培地中で細胞ペレットを再懸濁。
7. シード2×10 10cmの細胞培養皿で^{5個の細胞}と、手順7.6から7.1を繰り返す前に3~4日、37℃、加湿5％CO ₂インキュベーター中で細胞を培養します。

出荷のための耳の8準備

注意：Tを実行彼無菌細胞培養フード中でその後の工程。

1. 適切な機関のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
2. 細胞培養フードにオートクレーブ処理ハサミやピンセットを配置します。
3. 50ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルを完全培地を追加します。
4. はさみでマウスの耳（〜1cmの半径）をカットします。
5. ピンセットを用いて（ステップ3で調製した）を50mlのコニカルチューブに耳を転送します。
6. 適切なボックスにRTで出荷する前にパラフィルムで50mlコニカルチューブを密封。

結果

組織破片のかなりの量の組織の結果からの線維芽細胞の抽出（ 図1）。組織片とは対照的に、線維芽細胞を1日培養の3との間の組織培養プラスチック表面に付着します。線維芽細胞培養物の培地は、安全に大幅文化（ 図2）に存在するデブリのレベルを減少させるべきである文化、の3日目に変更することができます。線維芽細胞は、細長い形態とはっきりと見える細?...

ディスカッション

ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するために、単純な、安価で高速な実験手順を提供します。抽出は、組織の3日後に分離以内に付着し、急速に分裂する線維芽細胞を生じるはずです。初代細胞の重要な制限は、老化、永久的な増殖停止¹⁵です。プロトコルを使用して、線維芽細胞培養物は、サイズの増加（2〜3倍の増加）と拡大に失敗、線維芽細胞が老化...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG