Una serie di test a motore in neonatale topo modello di paralisi cerebrale

Riepilogo

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Abstract

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Introduzione

Lo sviluppo di nuovi modelli di infortunio o di malattia pediatrica utilizzando roditori è spesso difficile a causa della sorprendente capacità di entrambi i ratti e topi di recuperare rapidamente da lesioni neurologiche. Pertanto, al fine di convalidare qualsiasi nuovo modello di malattia pediatrica, accuratamente esaminando i cambiamenti cellulari e molecolari devono andare di pari passo con esiti comportamentali. In molti modi, il recupero comportamentale funzionale può essere più importante di cambiamenti cellulari sottostanti in termini di rilevanza terapeutica e traslazionale. Come i ricercatori saperne di più sulla ferita nell'adulto e nel neonato, è chiaro che le loro risposte sono molto diversi e non possono essere estrapolati tra i due. Ad esempio, i topi neonati mostrano diversi livelli di fattore di crescita nervoso, fattore neurotrofico derivato dal cervello, neurotrofina-3 e gliali fattore neurotrofico delle cellule linea di derivazione dopo un trauma del midollo spinale ^1,2. Inoltre, i neonati hanno una significativa perdita di barriera emato-encefalica dopo l'ictus ^3, demonstrate corticale riassetto neurone dopo periferici lesione del nervo ^4, e hanno un astrogliosis ritardato o rallentato in seguito a lesione del midollo spinale e ipossia-ischemia ^5,6. Pertanto, è importante che traslazionale ricerca pediatrica utilizzare modelli evolutivamente equivalenti e che tali modelli vengono valutati per entrambi i cambiamenti cellulari / molecolari e test comportamentali adatti alla loro età.

Paralisi cerebrale (CP) è un disturbo motorio che colpisce 3: 1000 nati vivi ogni anno (NIH). I bambini con CP presentano una gamma di sintomi e patologie associate, a seconda della gravità della malattia. Difficoltà con il movimento e il coordinamento sono i segni più comuni, insieme a ritardi nel raggiungimento del motore tappe dello sviluppo. Altri segni includono tono muscolare anormale (sia aumentato o diminuito), ridotta capacità motorie, difficoltà a camminare, sbavando eccessiva e la deglutizione, e ritardi del linguaggio (NIH). La causa di fondo di CP si crede di essereuna mancanza di ossigeno e / o il flusso di sangue al cervello durante il periodo di pre o peri-parto, o fino a un anno post-partum. Inoltre, l'infiammazione è ora ritenuta un componente chiave nello sviluppo di CP.

La maggioranza dei casi di CP sono associati con il bianco danno la materia intorno ai ventricoli, noto come leucomalacia periventricolare (PVL). Questa caratteristica neurologica suggerisce che l'insulto iniziale che porta al CP si verifica durante il periodo di sviluppo del cervello quando i oligodendrociti sono più vulnerabili agli insulti. Il periodo di crescita rapida degli oligodendrociti in un essere umano, anche il periodo in cui gli oligodendrociti sono i più sensibili al danno, è tra i 24 - 32 settimane di gestazione. Nel roditore, il periodo equivalente è giorni post-natale 2 - 7 ^7, ed è quando CP è indotta in questo modello.

Il modello di topo neonatale di CP che è stato utilizzato per effettuare i test descritti qui combina ipossia e ischemia con l'infiammazione di creare un injury che imita meglio la neurodegenerazione visti in CP umana. Questo modello affronta alcune delle principali carenze riscontrate in altri modelli animali di CP, che mancano di deficit motori distinti che assomiglia pazienti in CP umani, così come distinta danni sostanza bianca. Precedenti studi da un collaboratore utilizzando lo stesso modello hanno dimostrato che l'aggiunta di infiammazione aumenta il danno sostanza bianca, così meglio emulare il PVL osservati nei bambini con CP ^8. Sulla base dei dati precedenti, questo documento presenta una serie completa di test del motore neonatali al fine di valutare i cambiamenti nel comportamento del motore, come l'età degli animali.

Protocollo

NOTA: Tutti gli interventi chirurgici su animali sono stati eseguiti in conformità con il reparto lare di Temple University e politiche IACUC e procedure. C57BL / 6 dighe e padri sono stati acquistati da Charles River Laboratories e sono stati alloggiati in gabbie di allevamento con un ciclo di 12 ore luce / buio (luce su 7:00-19:00) con libero accesso a cibo e acqua. coppie nidificanti prodotte dimensioni dei cuccioli tra 5 - 10 cuccioli.

Chirurgia 1. paralisi cerebrale induzione

1. NOTA: La paralisi cerebrale è stata indotta usando giorno post-natale (PND) 6 cuccioli di topo, come descritto in precedenza ^8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
2. Mettere un cucciolo in una ciotola di vetro su ghiaccio con un laboratorio di pulire per proteggere la pelle del cucciolo. Controllare per il piano anestetico appropriata pizzico piedi e mancanza di movimento. Spostare il cucciolo di un impacco di ghiaccio imbottita per un intervento chirurgico.
3. Sterilizzare la pelle del cucciolo utilizzando 70% di etanolo. Una volta asciutto, utilizzare un # 11 sterile bla chirurgicode e fare 1 cm un'incisione nel collo.
4. Utilizzando un microscopio stereoscopico chirurgica, isolare il diritto arteria carotide comune con un piccolo gancio e cauterizzare utilizzando un cauterizer portatile tenuto in mano. Visivamente che l'arteria è occlusa. chirurgia Sham include la visualizzazione e l'isolamento della carotide comune senza cauterizzazione.
5. Riallineare la pelle e vicino usando suture colla (n-butil cianoacrilato).
6. Posizionare il cucciolo su una piastra elettrica C 34 ^o per 30 minuti per monitorare la respirazione spontanea e il movimento normale.
7. Restituisce il cucciolo (s) per arginare per 30 min.
8. Posizionare i cuccioli su una piastra elettrica o altro dispositivo di riscaldamento fissata a 34 ^° C all'interno di una camera di ipossia fissato al 6% di ossigeno per 35 min. L'ossigeno viene sostituita con azoto. Seguire da vicino il livello di ossigeno da camera e temperatura per risultati lesioni coerenti.
9. Rimuovere i cuccioli dalla camera di ipossia e restituirli al pad di riscaldamento.
10. Intraperitoneale iniettare lipopolysaccaride diluito in soluzione fisiologica sterile a 1 mg / kg e tornare il cucciolo alla diga. finte iniezioni sono iniezioni di soluzione salina solo.

2. I test neonatale a motore

NOTA: Il PND 8, 48 ore dopo l'induzione CP, cuccioli di topo sono testati per lo sviluppo neurocomportamentale. I cuccioli sono testati all'interno di un blocco 4 ore prima di mezzogiorno per eliminare il tempo di differenze nel comportamento giorno. I cuccioli vengono rimossi dalla diga per non più di 15 minuti alla volta per evitare una rapida perdita di problemi di surriscaldamento corporeo e la fame / separazione. Inoltre, cuccioli possono riposare tra test in modo che gli sforzi massimali saranno suscitato su ogni prova. La base dei test del motore neonatali è adattato usando la batteria di Fox di test ^10,11 e l'adattamento dei test ¹² di Fox di Wahlsten, nonché pubblicazioni TREAT-NMD e altri comportamenti (come indicato nel testo per ogni prova). batteria di Fox di test sono appropriati per PND 2 - 21. Di test di Fox, la pastellay qui presenti include: riflesso di raddrizzamento, afferrare reflex, geotassi negativi (chiamati provino verticale nella batteria di Fox) e la forza di presa quattro arti (modificato da Fox e Wahlsten del test schermata di arrampicata). Qui, la deambulazione, la forza degli arti anteriori, e la forza degli arti posteriori sono testati anche per distinguere il comportamento motorio riflessiva tra farsa e mouse CP cuccioli. Per eliminare i miglioramenti sui test a causa di apprendimento, le prove sono state limitate ad un massimo di 3 prove dove ha notato. Tutti gli altri test avevano solo una prova per animale.

1. Deambulazione (Figura 1) (adattato da un protocollo di ratto ^13):
   NOTA: La scansione è un comportamento sviluppato nelle prime ore del cucciolo mouse tra PND 0-5, in cui i topi di punti cominciano a passare a piedi, da 5 - 10 giorni ^14. Al PND 8, la prova di deambulazione si avvale di questo corso tempo di transizione. Deambulazione può tuttavia essere ottenuto per tutta la durata di un mouse e può essere determinato a qualsiasi età.Poiché non vi è alcuna possibilità per l'apprendimento, la prova deambulazione può essere ripetuto più volte necessario attraverso il corso dell'esperimento.
   1. Topi posto in un contenitore chiaro dove i topi sono visibili dalla parte superiore e la parte. Utilizzare dolce sollecitazione toccando coda del cucciolo di motivare il cucciolo a camminare.
   2. Punteggio deambulazione per 3 minuti utilizzando la seguente scala: 0 = nessun movimento, 1 = strisciando con il movimento degli arti asimmetrica, 2 = lento strisciare, ma il movimento degli arti simmetrica, e 3 = veloce strisciare / a piedi.
      NOTA: Qui, il movimento degli arti simmetrica viene descritto dove hindpaws incontrano frontpaws in ogni fase, e ogni passo senza problemi le transizioni alla fase successiva. Un mouse che visualizza il movimento degli arti asimmetrica ha posizionamento zampa irregolare e transizioni da una fase all'altra non sono uniformi.

Figura 1. Il passaggio daCrawling a piedi può essere distinto dal Osservando la Hindpaw, così come la testa e di coda. (A) Durante la scansione, la zampa tutta la schiena, dalle dita al tallone, tocca il terreno, quando deambulazione, come indicato con (*). Un modello a piedi adulto è visto quando solo le dita dei piedi e la parte anteriore del hindpaw toccano il suolo (il tallone è elevata, deonoted da [**]). (B) La testa e la coda di un topo che striscia è basso a terra. La testa comincia a salire durante la transizione da strisciare a piedi. La transizione è completa quando sia la testa e la coda sono elevati e solo la parte anteriore del hindpaw tocca il suolo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Angolo del piede degli arti posteriori (figura 2)
   NOTA: C'è un cambiamento evolutivo apparente nella postura degli arti posteriori come il mouse matura da strisciare a piedi, dove gli arti posteriori sono posizionati sotto il corpo durante la marcia, l'angolo tra l'arti posteriori è minore dell'angolo visto in scansione. Anche se l'angolo del piede arti posteriori cambia nel tempo, cuccioli di topo della stessa età con lesioni o malattie diverse possono essere confrontati. Simile al test deambulazione (3.1), non vi è alcuna possibilità per l'apprendimento. Così, il test angolo del piede hindlimb può essere ripetuto più volte necessario attraverso il corso dell'esperimento.
   1. Sia in una scatola trasparente campo aperto o un'area chiusa, montare una videocamera dal basso che dall'alto, rispettivamente per registrare il cucciolo mentre si sposta intorno al campo. Utilizzare dolce sollecitazione toccando coda del cucciolo di motivare il cucciolo a camminare. Record per due minuti.
   2. Utilizzando le registrazioni video, misurare l'angolo del piede dei cuccioli tracciando una linea dall'estremità del tallone / tibia alla punta del più lungo (mezzo) tep. Solo prendere la misura in cui il cucciolo sta eseguendo un passo completoin linea retta e entrambi i piedi a terra. Non effettuare misure, mentre il cucciolo è fermo o mentre il cucciolo sta girando.
   3. Misurare tre a cinque set di angoli del piede e calcolare l'angolo medio per ogni cucciolo testato.

Figura 2. angolo del piede degli arti posteriori può essere utilizzato per determinare Gait Anomalie. L'angolo di piede può essere misurata tracciando una linea dalla metà del tacco attraverso il centro (la più lunga) cifre. Animali feriti hanno un angolo di piede migliori rispetto al normale (vedere Rappresentante dei risultati, angolo del piede). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Righting superficie (figura 3):
   NOTA: Il riflesso di raddrizzamento è la capacità motore per un cucciolo mouse per poter capovolgere sui piedi da una posizione supina. L'età media del riflesso di raddrizzamento a comparire nei roditori è PND 5 con una gamma da PND 1 -. 10 ¹⁵ Poiché questa prova è un riflesso, non vi è alcuna componente di apprendimento e può essere ripetuto per tutto il periodo di sperimentazione.
   1. Posizionare cuccioli sulla schiena su un batuffolo di cotone o foglio di banco e tenerla in posizione per 5 secondi.
   2. Rilasciare i cuccioli e registrare il tempo necessario il cucciolo di tornare alla posizione prona, nonché la direzione di raddrizzamento (destra o sinistra). Un totale di un minuto è dato per ogni prova, se necessario.
   3. Ripetere per un totale di tre prove.

Figura 3. raddrizzamento di superficie. Questo test richiede un controllo del tronco e può testare per gli squilibri posturali. pazienti in CP umani possono avere deficit nel loro nucleo.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Negative geotassi (figura 4)
   NOTA: L'età media per reflex geotassi negativo ad apparire nei roditori è PND 7 con un range da PND 3 - 15 ¹⁵ Il test geotassi negativo valuta coordinazione motoria in topi giovani.. I topi sono posizionati rivolti verso il basso un pendio e, grazie ai segnali vestibolari di gravità, i cuccioli si rivolgono a faccia in su per il pendio. La risposta di stimolo, o taxi, è un comportamento innato.
   1. Posizionare il cucciolo con la testa rivolta verso il basso su una pendenza di 45 ^° e tenerlo premuto per 5 secondi.
   2. Rilasciare il cucciolo e registrare il tempo e la direzione il cucciolo si volta verso l'alto. tempo di prova totale è di 2 min.
   3. Ripetere per un totale di tre prove. I topi che cadono giù per il pendio o non riescono a trasformare può essere ri-testati, eliminati, o dato un punteggio pari a zero.
      NOTA: Questa decisione è lEFT per l'esaminatore, come a volte i cuccioli rotolerà giù per il pendio a causa di sonnolenza, piuttosto che di debolezza. Una volta che la decisione è presa su come segnare cuccioli che cadono giù per il pendio, si segnala nei metodi e dovrebbe essere coerente in tutta la sperimentazione di tutti i soggetti.

Figura 4. Negativo geotassi. Motore e l'input vestibolare è richiesto per il mouse di riconoscere il suo orientamento su un pendio e girare intorno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Frontale arto sospensione (Figura 5) ^16; adattato da ^{17, 18:}
   NOTA: Sospensione anteriore-arto mette alla prova la forza degli arti anteriori dei cuccioli, tra cui il braccio e la forza zampa. Tla sua prova non è raccomandato per i cuccioli di età inferiore ai PND 10 ^15. Pups sono autorizzati a cogliere un filo appesi ad un oggetto stabile e appendere sopra il filo con entrambe le zampe anteriori. L'area test è finita una zona di rilascio imbottita. Il test in grado di rilevare destra / sinistra differenze di forza laterale. L'apprendimento e l'assenza di rinforzo negativo può portare ad un aumento non-partecipazione. I topi che cadono immediatamente quando viene rilasciato o il fallimento di cogliere, quando sono immessi sul filo sono indicativi di non partecipazione.
   1. Tenere i cuccioli saldamente dal corpo e consentire loro di cogliere il filo con entrambe le zampe anteriori.
   2. Rilasciare il cucciolo. Usando un timer o cronometro, registrare il tempo totale di cadere, così come paw debolezza.
      NOTA: zampa debolezza viene determinato se un cucciolo scende costantemente dal filo con una zampa davanti all'altro piuttosto che rilasciare dal filo con entrambe le zampe contemporaneamente.
   3. Ripetere test per un totale di tre volte.

Figura 5. Front-Limb sospensione. Questo test sospensione provoca tensione nelle arti anteriori fino affaticamento muscolare. Con questo approccio, la forza di base nelle arti anteriori sono stabiliti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

6. Hindlimb sospensione (Figura 6):
   NOTA: Questo test sospensione determina la forza degli arti posteriori. Si tratta di un test progettato specificamente per i neonati ed è stato inizialmente utilizzato su animali tra PND 2-12 ^19,20, ma può essere adattato per topi fino a PND 14. Questo test in grado di rilevare le differenze di forza arti posteriori destro / sinistro e funzione neuromuscolare. Uno standard conica da 50 ml viene utilizzato, imbottito con salviette di laboratorio. Simile al test di sospensione anteriore degli arti, questo test può essere appresa, soprattutto il peccatoce vi è alcuna conseguenza negativa a cadere. Pertanto, l'aumento non partecipazione, visto da topi cadono appena rilasciata o mancata stare quando posizionato sul bordo del tubo, può essere osservato.
   1. Usando una conica da 50 ml, posto cucciolo viso delicatamente verso il basso nel tubo con le sue zampe posteriori appeso sopra l'orlo.
   2. Rilasciare il cucciolo. Osservare la posizione degli arti posteriori.
   3. Punteggio postura secondo i seguenti criteri.
      NOTA: Punteggio di 4 indica normale separazione degli arti posteriori con la coda sollevata; punteggio di 3 significa debolezza è evidente e zampe posteriori sono più vicini ma raramente si toccano; punteggio di 2 indica arti posteriori sono vicini gli uni agli altri e spesso commovente; punteggio di 1 mostra una debolezza è evidente e quelle posteriori sono quasi sempre in posizione giunte con la coda sollevata; un punteggio di 0 indica costante clasping delle arti posteriori con la coda abbassata o il fallimento di trattenere il tubo per qualsiasi periodo di tempo.
   4. Conte tira se necessario. A tirare è qualified quando il cucciolo tenta di sollevare il corpo utilizzando le zampe posteriori mentre sospeso sul lato del tubo conico.
   5. Usando un timer o cronometro, registrare la latenza cadere.
   6. Ripetere l'intero test in triplicato.

Figura 6. Sospensione degli arti posteriori. (A). Questo test sospensione provoca tensione nelle zampe posteriori fino affaticamento muscolare. La forza di base e la postura nelle arti posteriori sono stabiliti. (B). Punteggio. Nota i numeri sopra i topi rappresentativi che dimostrano la possibile punteggio postura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

7. Grip Forza (Figura 7):
   NOTA: Questo test esaminerà la zampa strength di tutte e quattro le zampe contemporaneamente. Un filo schermo 16 x 18 in fibra di vetro viene utilizzato. L'età media per un roditore possa afferrare uno schermo orizzontale è PND 8 con una gamma da PND 5 - 15 ¹⁵ Fox utilizzato il test schermo orizzontale quattro ramo dal PND 2 -.. 21 ¹⁰ Questo test viene modificato dallo standard orizzontale provino; qui lo schermo è ruotato lentamente da una posizione orizzontale a quella verticale, a sfidare l'attaccamento di tutti e quattro gli arti ^21; adattato da Corti S ^16. Se il mouse aggrappa alla maglia schermo quando invertito a 180 °, registrare la latenza cadere. Inoltre, nota il peso del corpo. Un impulso di appendere può essere calcolata come [peso (g) x latenza cadere (sec)] riflette la forza necessaria per resistere alla gravità.
   1. Utilizzando un pezzo di rete metallica, posizionare il cucciolo sullo schermo. Lasciare che il cucciolo di regolare a questo ambiente per circa 5 secondi.
   2. Invertire schermo lentamente a 180 gradi. Registrare il angl approssimativae dello schermo quando il cucciolo si stacca.
   3. Ripetere l'operazione per un totale di tre prove e la media dei processi.

Figura 7. Grip Forza. I topi sono tenuti a sostenere la tensione muscolare in tutti e quattro gli arti con l'aumentare della forza gravitazionale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

8. Cogliere Reflex (Figura 8)
   NOTA: Il riflesso cogliere appare di solito nei roditori a PND 7 con un range da PND 3 - 15 ¹⁵ Ogni zampa è testata singolarmente, quindi il test può rivelare problemi anteriore o arti posteriori, nonché le questioni unilateralità.. Come è un riflesso, questo test può essere ripetuto fino a quando appare il riflesso. Non è incline a imparare. Come un importante avvertimento, questo test non distingue forza afferrare, solo la capacità, e deve essere testato prima di 15 giorni di età, quando i topi giovani cominciano a cogliere a causa della paura di risposta.
   1. Tenere il mouse la collottola, simile al modo in cui un cucciolo mouse viene effettuata dalla diga. Questa stretta provoca il cucciolo di diventare istintivamente immobile e rilassato, consentendo facilità di test.
   2. Ictus ogni zampa del cucciolo con l'ottuso, lato di una lama di rasoio arrotondato.
   3. Testare ogni zampa individualmente e registrare la presenza o l'assenza di afferrare e 1 punto a zampa con cui le afferra mouse.
      NOTA: Il punteggio per il diritto preferenza zampa è al 100% per il diritto preferenza zampa, - - -100% per la preferenza zampa sinistra, il 50% per entrambe le zampe afferrare, e 0% per non afferrare le zampe. L'equazione per determinare questi numeri è [(zampa destra - zampa sinistra) / (zampa destra + zampa sinistra + entrambe le zampe)] x 100%.

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Figura 8. Cogliere Reflex. Perché topi neonati non hanno una forte risposta di paura, questo test determina rigorosamente il riflesso plantare / palmare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

9. Cliff Avversione (Figura 9):
   NOTA: i test di avversione Cliff labirinto riflessi, così come la forza e il coordinamento e possono essere utilizzati per testare i cuccioli da PND 1-14 ^22. Una scatola di pre-profumata (una scatola in cui è stato consentito un minimo di 5 topi di vagare liberamente) con una sporgenza elevata piatta viene utilizzato e il cucciolo è posto con le cifre solo delle loro zampe anteriori e la loro muso posizionato sopra il bordo. Il punteggio è effettuata contando il tempo totale necessario il cucciolo di allontanarsi dalla scogliera e muovere le zampe e muso lontano dal bordo. Se nessuna risposta è visto dopo 30 sec, il test viene interrotto.Se il cucciolo cade fuori dal bordo, un singolo trial supplementare può essere eseguita.
   1. Utilizzando una vista laterale, posizionare il cucciolo sul bordo della scatola pre-profumato, facendo in modo che le zampe anteriori, cifre e il muso sono le uniche parti sopra il bordo.
   2. Rilasciare cucciolo e avviare il timer.
   3. Una volta che sia muso e zampe sono state rimosse dal bordo, fermare il tempo del timer e registrare.
   4. Ripetere prova per un totale di 3 prove. Se il cucciolo non si muove lontano dalla scogliera entro 30 secondi, nessun punteggio è dato.
      NOTA: La determinazione se il cucciolo è un non-partecipante contro deteriorate viene lasciata a discrezione dell'esaminatore. L'altezza della scogliera può essere regolata per l'età del cucciolo per garantire la sicurezza del cucciolo. Un'altezza più piccola può essere utilizzato con un "pavimento" black per emulare una maggiore altezza.

figursquilibri e 9. Cliff avversione. vestibolari sono misurati con il test scogliera avversione. Qui, gli occhi del cucciolo sono ancora chiusi così la paura non è il fattore trainante di allontanarsi dal bordo della scogliera. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. significatività statistica

1. Utilizzando un software statistico analizzare i risultati. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM). I test sono parametrici e, quindi, esaminare i dati utilizzando le analisi t-test.
   NOTA: Gli esperimenti non sono stati progettati per verificare le differenze di genere. Le differenze sono considerate statisticamente significative quando p <0.05.

Risultati

I topi sono stati testati da P7 (24 ore dopo l'intervento chirurgico) a P13 (1 settimana dopo l'intervento chirurgico), usando i mouse diverso per ogni time-point in modo che l'apprendimento di una paradigma di test non era una variabile di confondimento. P8 è stato selezionato come risultati rappresentativi, come topi hanno mostrato i maggiori deficit a questo punto di tempo.

Transizione da Crawling a piedi è ritardato di CP topi neonati

pazienti in CP umani hanno anomalie dell'andatura, che vanno dalla punta di piedi per un'andatura scissored. Dato che questo modello CP display andatura deficit simili agli esseri umani, la deambulazione è stata valutata. I topi sono stati lanciati sulla simmetria andatura e il movimento degli arti-zampa durante una passeggiata retta. A 48 ore dopo l'intervento chirurgico (PND 8), i topi CP avevano meno movimento simmetrico arto e una "strisciante" andatura rispetto alle loro controparti sham (punteggio medio deambulazione: CP 1.083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1.639 ± 0,4859, n = 9; p <0.05, Figura 10). In una settimana, sia CP e topi sham sono passati a camminare (dati non riportati).

Figura 10. CP mouse Pups non Ambulate così come Shams. Topi Sham (barra nera) hanno un punteggio medio di 1.639 ± 0,4859 (n = 9), vale a dire il loro sviluppo ambulatoriale cade tra il movimento degli arti asimmetrica e lento strisciare. topi CP (barra grigia) ricevono un punteggio medio di 1.083 ± 0,6337 (n = 12), il che significa la loro deambulazione è meno sviluppata e tendono ad avere il movimento degli arti asimmetrica. I dati sono espressi come media ± SEM; * È p <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

HinAngolo del piede dlimb è aumentata in CP

Oltre alla deambulazione, degli arti posteriori piede ad angolo è stata valutata. Otto giorni di età cuccioli farsa del mouse a piedi con i loro hindpaws rivolto in avanti, rispetto ai topi HIL, che hanno divaricate hindpaws quando si cammina in linea retta (figura 2; angolo medio: CP 77.48 ± 9,848, n = 9, vs sham 54.54 ± 8,043, n = 11; p <0,0001, Figura 11). Questo aumento dell'angolo correla con instabilità andatura, dal fatto che i cuccioli bisogno di aumentare l'angolo di loro zampe posteriori per stabilizzare la loro andatura e assistere con equilibrio e coordinazione.

Figura 11. CP mouse Pups Splay loro hindpaws quando si cammina. Topi CP (barre nere) hanno un angolo medio tra i loro arti posteriori di 77.48 ± 8,043 (n = 11), mentre i topi sham (grigio b ars) hanno un angolo medio di 54,54 ± 9,848 (n = 9). I dati sono espressi come media ± SEM; **** È p <0,0001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I topi CP Non mostrare deficit quando Righting Surface

Il test di superficie di raddrizzamento è stato incluso come alcuni pazienti CP hanno alterato controllo del tronco (Heyrman et al., 2013). Inoltre, il sistema vestibolare è necessario rilevare la necessità di raddrizzamento e ci sono deficit vestibolari in alcuni pazienti CP ^23. topi CP non mostrano deficit significativi quando raddrizzamento rispetto ai controlli sham (dati non riportati).

I topi CP Eseguire la stessa come Sham in negativo geotassi Testing

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> geotassi negativo è usato per testare la coordinazione motoria nei giovani cuccioli I topi sono in discussione da essere posto in discesa su una superficie inclinata ritardo o mancata salita orientare potrebbe indicare deficit.. in coordinazione, equilibrio, o ingresso vestibolare. topi CP non mostrano deficit quando provocati con geotassi negativi rispetto ai topi sham (dati non riportati). Inoltre, i topi CP non hanno mostrato una preferenza per girare verso un lato rispetto ad un altro, quando ri-orientamento .

Front-Limb test sospensione è opportuna per topi anziani di 10 giorni

pazienti in CP sono diminuiti del tono muscolare e deficit nelle abilità motorie, come afferrare. Per verificare la debolezza di questo modello di topo, abbiamo usato un test di sospensione anteriore degli arti. Inoltre, questo modello utilizza danno ischemico unilaterale e retro-ness potrebbero essere determinati con questo test sospensione. Questo testè meglio per i topi di età superiore ai 10 giorni ^15. A 8 giorni, due giorni dopo un trauma, non vi erano differenze significative tra CP e topi sham (dati non riportati).

Forza arti posteriori è diminuito nei topi CP

pazienti in CP umani hanno spesso bisogno di parentesi graffe o dispositivi di assistenza a piedi a causa della mancanza di controllo del motore e forza. Al fine di confrontare il modello CP roditore per gli esseri umani, la forza degli arti posteriori è stata valutata utilizzando il test di sospensione degli arti posteriori. Quando sospeso dal lato di un tubo conico, topi CP hanno mostrato la debolezza degli arti posteriori, come dimostrato da una diminuzione della appeso punteggio (arti posteriori punteggio appeso: CP 3.468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, Figura 12). Nessuna differenza è stata osservata nel tempo di sospensione hindlimb (dati non mostrati). Così, simile a pazienti in CP umani, topi CP dimostrano hindlIMB (gamba) debolezza.

Figura 12. I topi Sham sono leggermente ma significativamente più forte nelle loro arti posteriori rispetto ai topi CP. In un punteggio impiccagione di 3,891 ± 0,1329 (n = 13), i topi sham (barra nera) mostrano la separazione più degli arti posteriori, e quindi una più forte presa di posizione degli arti posteriori, quando appeso al bordo di un tubo di topi CP (barra grigia) con un voto medio impiccagione di 3.468 ± 0,5561 (n = 13). I dati sono espressi come media ± SEM; * È p <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Grip forza è diminuita Following CP Injury

Afferrando con tutte e quattro le zampe è importante per un roditoretermini di arrampicata e correre su superfici irregolari. Grip richiede notevole forza sostenuta, invece di destrezza o forza lineare, soprattutto nelle cifre e zampe ^24. I topi sono stati tenuti a tenere il loro peso corporeo su uno schermo di rete metallica rovesciata. Topi CP non sono stati in grado di mantenere la loro presa e questi topi è sceso ad angolo significativamente più bassi (quattro arti angolo medio: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs sham 96.57 ± 10.836, n = 9; p <0.05, figura 13). Questi dati mostrano che vi è un deficit significativo nella forza di presa in topi CP.

Figura 13. I topi hanno CP Grip più debole rispetto Shams. Topi Sham (barra nera) può afferrare un angolo invertito media di 96.57 ± 10,836 (n = 9). topi CP (barra grigia) possono raggiungere solo un angolo rovesciata di 75,627 ± 24.48 (n = 11). I dati sono espressi come media ± SEM; * È p0; 0.05. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I deficit Grasping Reflex sono evidenti nei topi CP

Insieme con deficit motorie, movimenti motorie sono anche compromesse nei pazienti CP ^25,26. Il riflesso cogliere nell'uomo è presente alla nascita e scompare intorno 5-6 mesi. Tuttavia, i cambiamenti riflesso di presa, quali velocità esagerata o la forza di afferramento, mancata afferrare o il riemergere del riflesso afferrare dopo 6 mesi di età, tutti indicano danni al sistema nervoso. Per confrontare afferrare nel modello CP, i deficit di presa riflessivi sono stati determinati.

A 48 ore dopo l'infortunio, topi CP dimostrano una diminuzione nel cogliere il riflesso (zampe medie coltein 48 ore: CP 2.429 ± 0,9376, n = 14, vs sham 3.214 ± 0,8018, n = 14; p <0.05, Figura 14A). C'era una leggera, ma non significativo aumento destra preferenza zampa nelle zampe anteriori (dati non riportati). C'è stata una significativa preferenza zampa destra nelle hindpaws (CP 75,0 ± 42,74, n = 14, vs sham 17.86 ± 54.09, n = 14; p <0.005, Figura 14B). Una settimana dopo l'infortunio, topi CP mostrano deficit di presa (zampe medie colte a 1 settimana: CP 2.75 ± 1.035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0.05, Figura 14C), senza preferenza zampa notevole .

Figura 14. I topi CP hanno deficit afferrare, nella hindpaws, controlaterale alla Cervello Regione feriti. (A) 48 ore dopo un trauma (PND 8), i topi CP (barra grigia) afferrare un bastone con, in media, un minor numero di zampe di farsa animaLS (barra nera). topi (B) CP (barra grigia) mostrano una preferenza per afferrare con la hindpaw destra (controlaterale alla lesione) in contrasto con il hindpaw sinistra (omolaterale al danno). topi Sham (barra nera) Non visualizzare questo diritto preferenza zampa. Preferenza zampa destra è calcolato come ([zampa destra - sinistra zampa] / [zampa destra + zampa sinistra + entrambe le zampe] * 100) (C) Una settimana dopo un trauma, i topi CP (barra grigia) mostrano ancora afferrare deficit rispetto al. Shams (barra nera). I dati sono espressi come media ± SEM; * È p <0.05, ** è p <0.005. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I topi CP si allontanano dal bordo Durante avversione Cliff

Il test scogliera avversione si basa sulla paura intrinseca dei topi a girare away da una ripida scogliera e dirigersi verso la sicurezza. Anche se alcuni pazienti in CP hanno difficoltà vestibolari, così come il controllo del motore ridotta, i topi CP non hanno mostrato alcun deficit in questo test.

Discussione

Utilizzando modelli animali per studiare le malattie umane è rilevante solo se vi è sovrapposizione tra la risposta cellulare e molecolare tra uomo e roditori e che i test comportamentali eseguiti hanno rilevanza diretta per i sintomi umani. Uno dei principali problemi con gli studi sulle malattie pediatriche è che molti ricercatori utilizzano roditori adulti per creare il modello, così come la valutazione del comportamento degli adulti roditore, senza considerare le differenze di sviluppo che possono essere importanti per il processo della malattia. A causa di questi problemi, è importante che la ricerca sull'uso malattia pediatrica non solo la rettificato di sviluppo time-punti appropriata (ad esempio, lo sviluppo del sistema nervoso centrale umano a 28 - 32 settimane è equivalente ad un giorno post-natale 2-7 giorni roditore) ^7, ma anche test comportamentali che esamineranno motore del caso, i comportamenti di sviluppo sensoriali o riflessivi. Così, come si sviluppa ogni nuovo modello di malattia neonatale, deve essere rigorosamente testati per assicurare che il cellularee risposte comportamentali forniranno i dati traducibili più adeguati tra roditori e umana.

La paralisi cerebrale è un disturbo del motore, che persistono in età adulta. Un problema con molti dei modelli paralisi cerebrale disponibili oggi è la mancanza di ripetibile, test motore normalizzato in grado di correlare con i deficit osservati in pazienti pediatrici. In questo nuovo modello, che unisce ipossia, ischemia e infiammazione in un mouse neonatale, comportamento motorio è stata valutata utilizzando una serie di test specifici per topi neonati. Per ridurre la soggettività e aumentare la segnalazione quantitativa, diverse prove sono state modificate per includere molto specifica, ma facile valutare misure che possono essere standardizzati. Inoltre, le valutazioni anteriori e arti posteriori possono essere eseguiti separatamente, e le differenze sinistra / destra può essere determinato. Questa batteria di test è specifico per topi neonati fino a due settimane di età.

Questo modello CP dimostradifficoltà nel camminare (deambulazione, angolo del piede degli arti posteriori), nonché la debolezza specifici degli arti (sospensione di quattro arti, la sospensione degli arti posteriori), e deficit in riflessi di sviluppo (afferrare reflex). Anche se in questo studio solo un timepoint stato esaminato, questi deficit possono essere monitorati nel corso del tempo.

Ci sono altre batterie di test che possono essere utilizzati sul neonato, come ad esempio la batteria del Fox di test o di valutazione di ¹⁵ tappe dello sviluppo di Heyser. Tuttavia, questi test confrontare il neonato all'adulto, il cui risposte non può essere lo stesso, perché il neonato è ancora in via di sviluppo. La batteria di Fox e test assement di Heyser si basano su informazioni soggettive osservazionale con dicotomico valutazione (sì o no), piuttosto che dati oggettivi (angolo, postura basati sulla forza, ecc). A causa della soggettività di questi test, molti scienziati si sono adattati, aggiunto o rimosso criteri, rendendo così i loro risultati incomparabili agli altri e limiteing l'utilità dei dati in termini di stabilire un deficit di base per una particolare malattia o disturbo. Attraverso la creazione di una serie di test standardizzati a motore che sono qualitative e specificamente progettato per testare i neonati, i risultati dei singoli gruppi di ricerca possono essere preciso e affidabile segnalati e confrontati.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories	STRAIN CODE: 027	C57BL/6NCrl is the exact strain we use
Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish	Corning Life Sciences Glass	3140125	Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399).
Covered lead ring	Fisher Scientific	S90139C	Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish.
Scalpel Blade #11	World Precision Instrucments, Inc.	500240
Small Vessel Cauterizer	Fine Science Tools	18000-00
Micro Hook	Fine Science Tools	10064-14
Vetbond Suture Glue	3M	1469SB	n-butyl cyanoacrylate adhesive
Lipopolysaccharide	Sigma Life Science	L4391	Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated
12 x 12 inch opaque box	Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics	C4022	Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H;  http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html
Camera/camcorder	JVC	GC-PX100BUS	Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder.
Covidien Tendersorb™ Underpads	Kendall Healthcare Products Co	7174
WypAll L40	Kimberly-Clark Professional	5600	Any surface with moderate grip will do
Surface at 45 degree incline			We use a cardboard box.
Thin wire from a pipe cleaner	Creatology	M10314420	Any pipe cleaner from any craft store will work.
50mL conical tube	Falcon	352070
Fiberglass Screen Wire	New York Wire  www.lowes.com	14436	Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16
Razor blade	Fisherbrand	12-640	A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work.
OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway	PLASKOLITE INC	1AG2196A	Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning.
Protractor	Westscott	ACM14371