Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

Resumen

Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.

Resumen

Pulmón diferenciación linaje requiere la integración de las señales ambientales complejos que incluyen el factor de crecimiento de señalización, las interacciones célula-célula y las interacciones célula-matriz. Debido a esta complejidad, la recapitulación del desarrollo del pulmón in vitro para promover la diferenciación de las células madre a las células epiteliales del pulmón ha sido un reto. En este protocolo, los andamios de pulmón descelularizados se utilizan para imitar el entorno de 3 dimensiones del pulmón y generar células epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células madre. células madre embrionarias de ratón se diferencian en primer lugar al linaje endodermo utilizando un método de cultivo cuerpo embrioides (EB) con las células del endodermo activina A. continuación, se siembran en los andamios descelularizado y se cultivaron a la interfaz aire-líquido hasta por 21 días. Esta técnica promueve la diferenciación de las células sembradas a las células epiteliales de las vías respiratorias funcional (células ciliadas, células club, y células basales) sin suplementación adicional del factor de crecimiento. Esta configuración se define la cultura, Seru-M libre, barato y reproducible. Aunque no existe una contaminación limitada de linajes endodermo no pulmonares en la cultura, este protocolo sólo genera poblaciones epiteliales de las vías respiratorias y no da lugar a las células del epitelio alveolar. epitelios de las vías respiratorias generados con este protocolo se pueden utilizar para estudiar las interacciones célula-matriz durante la organogénesis de pulmón y para el modelado de la enfermedad o plataformas de descubrimiento de medicamentos de patologías relacionadas con las vías respiratorias, tales como fibrosis quística.

Introducción

Diferenciación dirigida de células pluripotentes a la estirpe de pulmón depende de eventos de señalización precisos en el microambiente ^1,2. Debido a la naturaleza dinámica de este proceso que ha sido un reto para imitar los acontecimientos precisos de la organogénesis de pulmón in vitro. Los informes recientes han utilizado estrategias de restricción de linaje por etapas con el factor de crecimiento soluble suplementación de los cultivos de dos dimensiones para lograr la diferenciación de pulmón ^3-8. En protocolos de diferenciación por etapas, las células pluripotentes, si las células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas, se diferenciaron primero en la capa de germen de endodermo definitivo. células endodérmicas fueron empujados posteriormente a un destino endodermo anterior y, posteriormente, a las células progenitoras de pulmón, como se identifica por la expresión del factor de transcripción que contiene homeodominio-NKX2-1. Estos progenitores de pulmón se diferenciaron adicionalmente a proximal (vía aérea) o células epiteliales de pulmón distales (alveolares) wiTH continuó suplementos de factores de crecimiento. Tales estrategias de 2 dimensiones han tenido cierto éxito en la generación de las células epiteliales del pulmón, sin embargo, hay varias limitaciones, incluyendo las eficiencias poco claros, la posible contaminación de otros de origen endodérmico, la falta de una estructura de 3 dimensiones (3D), y en algunos casos uso de cultivos indefinidos con suplementos de suero. Cultura de pluripotentes células diferenciadas o en andamios pulmonares descelularizados se utiliza cada vez más como un ensayo para evaluar el potencial regenerativo de las células sembradas en la formación de estructuras epiteliales del pulmón ^3,5,6,8,9. Tales informes cultura células sembradas en andamios con factor de crecimiento continuo o de suplementos de suero.

desarrollo de pulmón implica la división, migración, la expresión génica y la diferenciación de las células individuales en respuesta a señales ambientales. La matriz extracelular (ECM) es un entramado de glicoproteínas que además de proporcionar soporte estructural, dirige tissue morfogénesis mediante la integración y la regulación de estos procesos ^10,11. Al utilizar el andamio ECM de pulmón como una plataforma natural para la cultura endodermo para imitar mejor el entorno de desarrollo de pulmón in vivo, hemos generado células madre epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células en un cultivo definido 3D-ajuste con alta eficiencia y reproducibilidad.

Rata andamios ECM pulmonares fueron generados por descelularización, así como células endodérmicas derivados de ESC de ratón fueron generados y posteriormente sembradas en estos andamios. expresión dual de CXCR4 y proteínas c-KIT indica una identidad celular endodermo definitivo y células positivas tanto para Sox2 y expresión NKX2-1 son identificadas como células de las vías respiratorias (pulmonares proximales) progenitoras. Las células del endodermo definitivo se cultivaron en la interfase aire-líquido (ALI) para un máximo de tres semanas para generar células epiteliales de las vías respiratorias funcional in vitro.

Este protocolo promueve la diferenciación de pulmón linaje de definitiva endodermo a los 7 días, observados con la aparición de NKX2-1 ⁺ / ⁺ Sox2 progenitores tempranos pulmonares proximales. Para el día 14 y 21 de las poblaciones de células epiteliales de las vías respiratorias maduros cultivo emergen incluyendo ciliadas (TUBB4A ^+), club (SCGB1A1 ⁺⁾ y células basales con semejanza morfológica y funcional de las vías respiratorias de ratones nativos ⁽⁺ TRP63, KRT5 ^+). Este protocolo demuestra la importancia del microambiente 3D de matriz para lograr la diferenciación robusto a las vías respiratorias células epiteliales.

Protocolo

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales del Hospital for Sick Children Research Institute.

1. Preparación Andamios

1. Descelularización de pulmones
   1. La eutanasia a las ratas Wistar adultas utilizando cámara de CO _2. Lugar de los animales en la cámara y empezar a 100% la exposición al CO ₂ a una velocidad de llenado del 10-30% del volumen de la cámara por minuto.
      1. Observar animales de la inconsciencia; esto ocurrirá después de aproximadamente 2-3 minutos. Si la inconsciencia no se produce en este período de tiempo, comprobar la tasa y el sello de la cámara de llenado. Después de la inconsciencia, observar animales de color de los ojos se desvaneció y la falta de respiración. Si se observan tanto, mantener el CO ₂ de llenado durante 1-2 minutos y luego retirar los animales de la cámara para el procedimiento.
   2. Asegure animal para la disección de la superficie mediante la fijación de las patas delanteras y patas traseras, y rocíe el pecho y la zona del abdomen con 70% de etanol. Acceder al corazón y luNGS mediante la apertura de la cavidad torácica mediante una incisión vertical a lo largo del esternón.
   3. Hacer pequeñas incisiones a través de diafragma primero para hacer que los pulmones se retraigan, reduciendo la posibilidad de perforar los pulmones. Ligar la vena cava inferior con una sutura y colocar una pequeña incisión en la aurícula izquierda con pequeñas tijeras de disección.
   4. Usando una jeringa de 10 ml preparada con una aguja 25 G lleno de solución salina equilibrada heparinizada de Hank (HBSS) (10 U / ml de heparina en HBSS), iniciar la perfusión pulmonar mediante la inserción de la aguja en el ventrículo derecho para empujar el tampón a través de la circulación pulmonar (velocidad de 2 ml / min). Continuar este procedimiento hasta que los pulmones se vuelven blancos y el fluido que fluye desde la aurícula izquierda salga clara.
   5. Tras la perfusión, exponer la tráquea y canular con un catéter de plástico cerca del cartílago tiroides y seguro en su lugar con una sutura.
   6. Configuración de un sistema de perfusión por gravedad mediante la fijación de una jeringa de 10 ml a un soporte vertical y la abrazadera. Retire y démbolo de la jeringa iscard. Protección del punto máximo de llenado de cilindro de la jeringa a 20 cm por encima de los pulmones. Coloque una llave de paso de dos vías para el extremo de la jeringa, y un largo tubo de plástico para el otro extremo de la llave de paso para la entrega de solución de descelularización a la tráquea canulado. Verter la solución en la jeringa y permita que la solución para llenar tubo de plástico unido y el catéter.
      1. Lavado de los pulmones llenando a capacidad pulmonar total (aproximadamente 12 ml) durante 1 min y retirar el catéter de plástico de la tráquea para permitir que el fluido fluya fuera de los pulmones. No llenar jeringas más de 10 ml cuando lavaging pulmones para mantener la presión por debajo de 20 cm de _H2O
   7. Repetir el lavado de pulmones ocho veces con solución de descelularización, seguido de 10 lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   8. Diseccionar la tráquea y los pulmones libre de la cavidad del cuello y el pecho y retirar del animal. Mantener el tejido en PBS frío a 4 ° C hasta su preparación para sí vibratomectioning.
2. generación de sección gruesa
   1. Preparar aproximadamente 15 ml de 2% y 4% (w / v) de agarosa, y lo suficientemente 6% (w / v) de agarosa para incrustar todos los lóbulos en pequeños bloques rectangulares. Disuelva el polvo de agarosa de bajo punto de fusión en PBS en el microondas. La transferencia de la agarosa para tubos de 50 ml en un bloque de calor y mantener la temperatura por encima de 40 ° C para evitar la gelificación.
   2. Diseccionar pulmonar descelularizado al final de cada bronquio lobar para separar cada lóbulo (craneal, medio, accesorio, y los lóbulos caudal derecho y el lóbulo izquierdo) usando unas tijeras pequeñas. Pat secar cada lóbulo usando hojas absorbentes para eliminar el exceso de PBS y colocar dentro de 2% (w / v) de agarosa, mientras que en el bloque de calentamiento.
   3. Retire cada lóbulo después de 5 minutos de recubrimiento de agarosa, colocar en una placa de Petri y dejar que la superficie del gel por 1 min en un plato frío.
   4. colocar suavemente lóbulos de nuevo en 4% (w / v) de agarosa, fresco después de 5 min, y repetir recubrimiento una vez más con el 6% (w / v) de agarosa.
   5. Después de co secuencialIONES de cada lóbulo, incrustar cada lóbulo separado en 6% (w / v) de agarosa usando moldes de base de metal con al menos 3 mm de agarosa que rodea el tejido de los bordes. Orient cada lóbulo usando fórceps mediante el posicionamiento más grande borde plano del lóbulo en la superficie del molde de metal hacia el experimentador. Este borde será el lado fijo a la placa de muestra para vibratome seccionamiento.
   6. Permitir a los bloques de gel en placa fría durante al menos 30 minutos antes de seccionar con vibratome. Guarde los bloques en una cámara húmeda durante un máximo de 12 horas a 4 ° C antes de seccionar vibratome.
   7. Configuración del vibrátomo llenando la cámara de seccionamiento con PBS frío ^12. Mantener la temperatura fría a lo largo de seccionamiento con el baño de hielo circundante. Retire los bloques de moldes de metal y el uso de una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa que rodea lóbulos, mientras se mantiene aproximadamente 3 mm desde el borde del tejido.
   8. Fijar tejido al centro de la placa de muestra usando un adhesivo, y sumergir la placa en tél PBS-llenado cámara de seccionamiento. Configuración de seccionamiento límites en vibratome mediante la selección de los siguientes valores de la velocidad, amplitud, y espesor respectivamente: 0,2 mm / seg, 1,85 mm, y 350 micras.
      Nota: Tanto la sección longitudinal y transversal de la orientación del lóbulo son aceptables.
   9. Sección cada lóbulo completamente. Manualmente secciones cortadas gratis con pequeñas tijeras si un tramo no está separado por hoja al final de la secuencia de la sección. Recoger las secciones de andamios con cuidado y mantenerse en PBS en hielo hasta el siguiente paso.
      Nota: Secciones generados incluirán tanto en las zonas proximal y distal del pulmón y ambas fuentes se pueden utilizar para recelularización; sin embargo, la mayor parte de la superficie abarcará pulmón distal.
3. Descontaminación de las secciones de andamios
   1. Transferir las secciones de andamios de espesor 350 micrones de PBS para tubos de microcentrífuga (hasta 30 secciones / tubo) y se trata con nucleasa (90 U / ml en PBS) (ver Lista de Materiales) por 12 - 24 horas a temperatura ambiente, enun rotador.
   2. Después del tratamiento con nucleasa, las secciones de transferencia utilizando fórceps para nuevos tubos de microcentrífuga y se trata con solución antimicrobiana (200 U / ml de penicilina estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B en PBS) en condiciones estériles durante 6 horas a temperatura ambiente, en un rotador.
      Nota: Los andamios se pueden almacenar en solución antimicrobiana durante un máximo de una semana a 4 ° C antes de su uso.
   3. Después de la etapa de descontaminación con solución antimicrobiana, enjuague andamios dos veces con PBS en condiciones estériles y transferir a suero libre de medio de diferenciación (SFDM) antes de la siembra con células.

2. Preparación de células Endodérmico

1. El endodermo definitivo de inducción
   1. Mantener las líneas de ratón ESC menores, cultivo libre de suero sin alimentador usando condiciones 2i ^13. Iniciar la inducción endodermo mediante la eliminación de las células pluripotentes a partir de la cultura adherentes mediante tripsinización.
   2. Resuspender las células en SFDM y las semillas a una densidad de 20.000células / ml en placas adherentes bajas durante tres días sin cambio de medio para permitir la formación de EB.
   3. Después de tres días transfieren suavemente las EB en 50 ml tubos cónicos con una pipeta de 10 ml y dejar que se recogen en la parte inferior durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   4. Adecuadamente el material aspirado y añadir medios SFDM fresco suplementado con 50 ng / ml de activina A.
   5. Se siembran las células posterior en las placas adherentes bajas en una proporción 1: 2 densidad y la cultura durante tres días adicionales para alcanzar una diferenciación endodermo definitivo.
2. enriquecimiento de endodermo definitivo
   1. Recoger el día 6 EBS, disociar con tripsina y la etiqueta de c-KIT y la expresión de CXCR4 utilizando anticuerpos conjugados fluorescentes ^14.
   2. Ordenar las células marcadas utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para la expresión de ambos marcadores para obtener una población enriquecida endodermo definitivo ^15.

3. Configuración recelularización

1. interfase aire-líquidoconfiguración de la cultura
   1. Transferir cada sección de esqueleto descelularizado (paso 1.2.9) de SFDM a una membrana flotante hidrófobo (8 micras de tamaño de poro) usando pinzas estériles. Asegurar andamio secciones se distribuyen de manera uniforme en la membrana.
   2. Preparar 6- o placas de 12 pocillos, llenando los pocillos con 1 o 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Con cuidado, coloque las membranas en los pozos, lo que permite la membrana flote en la parte superior de los medios de comunicación, la creación de una configuración de la cultura aire-líquido.
2. La siembra de los andamios 3D
   1. FACS siguientes marcadores de endodermo definitivo (paso 2.2.2) cuentan células clasificadas utilizando un hemocitómetro, dejen de girar a 400 xg durante 5 minutos y se vuelve a suspender en SFDM. Resuspender las células para obtener un volumen que contiene aproximadamente 100.000 células / 10 l / andamios.
   2. Para recellularize andamios, pipeta de 10 l de células directamente en cada sección preparada desde el paso 3.1.2.
   3. Sustitución de los medios SFDM en cultivos cada 48 horas. Aspirar los viejos medios de comunicación mediante la celebración de la placa con una ligera inclinacióna fin de no perturbar la cultura. Añadir lentamente SFDM fresco a la cultura a lo largo del lado del pozo para evitar el hundimiento de la membrana flotante.
   4. Mantener los cultivos al aire líquido hasta por 21 días para lograr la diferenciación de las células sembradas en los epitelios de las vías respiratorias madura.
      Nota: recelularizado secciones pueden ser procesadas para la tinción de tejidos y de inmunofluorescencia microscopía (IF) en cualquier punto de tiempo durante el cultivo celular ^16.

Resultados

Como se describe en este protocolo, la diferenciación robusta del endodermo definitivo para madurar las vías respiratorias células epiteliales, se pueden obtener mediante el cultivo prolongado de células sembradas en las secciones de andamios de pulmón descelularizados. Se recomienda que los andamios descelularizados caracterizarse para asegurar (1) células huésped se eliminan por completo, y (2) proteínas de la matriz extracelular se conservan antes de utilizar andamios para la ...

Discusión

El protocolo descrito aquí genera epitelios de las vías respiratorias derivadas de CES maduros utilizando sólo los andamios pulmón natural para dirigir la diferenciación con ningún otro suplementación. Esta configuración se define la cultura, y barato, y reproducible libre de suero. No se requiere un factor de crecimiento de la suplementación del medio de diferenciación base. Métodos publicados anteriormente para la generación de células epiteliales de pulmón de células madre derivadas han utilizado estra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive