Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Resumen

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Resumen

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introducción

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocolo

Ética
Todo el trabajo se llevó a cabo bajo la aprobación del Ministerio del Interior británico los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 y la London School of Higiene y Medicina Tropical de Bienestar Animal y la Junta de Revisión de Ética. LLEGA directriz se siguen en este informe.

1. En Vivo La aprobación de Trypanosoma brucei brucei bioluminiscente

1. Retirar una acción criopreservados (denominado estabilizado) de T. segundo. brucei cepa GVR35-VSL-2 (disponible en el profesor John Kelly en la London School of Higiene y Medicina Tropical través MTA) de ⁹ de nitrógeno líquido y se deja que se equilibre a temperatura ambiente. Diluir estabilizado a 2 x 10 ⁴ tripanosomas / ml en pH estéril salina tamponada con fosfato de glucosa (PBS-G) 8,0 (1 L PBS + 15 g de glucosa) ^10.
   Nota: T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 no es infecciosa para los humanos y no requiere licencia SAPO instalaciones para llevar a cabo los experimentos.
2. inject un 20-25 g ratón hembra CD1 con 0,2 ml diluidos tripanosomas por vía intraperitoneal (ip) con una aguja de 25 G. Este es el "ratón donante". Coloque el ratón infectado en un libre de patógenos (SPF) -cage y alimentación ad libitum específico.
   Nota: Los ratones CD1 son una cepa no consanguínea y T. segundo. brucei infecciones GVR35 están bien caracterizados en esta cepa. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a cepas puras o modificadas genéticamente, pero es importante tener en cuenta que el color de la piel puede afectar a la sensibilidad de formación de imágenes ^6,9.
3. Monitorear la parasitemia periférica mediante el muestreo de sangre. Coloque el ratón en un retenedor de plástico y tomar 5 l de sangre de la cola por punción venosa con aguja 21 G o sangría y mezclar 1/10 con cloruro de amonio estéril 0,85% para lisar las células rojas de la sangre y permitir el recuento más fácil.
4. Contar la sangre diluida en un hemocitómetro Neubauer.
   1. Cargar la sangre diluida en ambas cámaras. Contar todo el centro grIdentificación de una cámara para dar N tripanosomas. La concentración de tripanosomas en la sangre = n x 10 ⁴ tripanosomas / ml, ajuste para cualquier factor de dilución y calcular la media de las dos cámaras.
      Nota: Después de aproximadamente 5-7 días después de la infección, la parasitemia periférica debe elevarse lo suficiente como para llevar a cabo una infección a una concentración de 2 x 10 ⁴ tripanosomas / ml.
5. Cuando los niveles de tripanosomas son suficientes para el número de ratones requeridos alta, pasar al paso 1.6. Un nivel de parasitemia de 6 x 10 ⁴ tripanosomas / ml en un ratón donante es suficiente para la infección de 10 ratones.
   Nota: Para tamaños de los grupos estadísticamente significativas, n = 6 para cada grupo de tratamiento de los ratones se necesitan ^8. Para otros modelos de infección, tendría que ser aplicada para determinar los tamaños de grupo apropiados los cálculos de potencia.
6. Coloque los ratones en una caja caliente (a 28-30 ° C durante aproximadamente 5-10 minutos) para permitir que las venas de la cola se dilaten.Para inducir la anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital con una aguja 25 G. Confirmar ratón se anestesia presionando suavemente las almohadillas de las patas para asegurar que no hay reflejo de retirada.
7. Heparinizar una aguja 21 G por alícuotas de 5 ml de heparina de 5.000 unidades USP / ml en un tubo de Bijou y chupando dos veces en y fuera de la aguja unida a una jeringa de 1 ml.
8. Tome el heparinizada 21 G aguja y jeringa de 1 ml, y realizar una punción cardiaca en el ratón paso anestesiado mediante la inserción de la aguja en el centro debajo de la caja torácica (una gota de sangre se acumule en la base de la aguja) y tire suavemente hacia atrás el émbolo a fin de no colapsar la cámara del corazón. Recoger un mínimo de 0,7 ml de sangre.
9. Diluir la sangre infectada para producir un inóculo de 2 x 10 ⁴ tripanosomas / ml en PBS-G pH 8,0 como paso 1.1 anteriormente.
   Nota: En este punto, la sangre restante se pueden criopreservar para producir estabilizado por mezcla con 8% de glicerol, 20% inactivado por calor ca fetalsuero LF (hi-FCS) y la sangre infectada del 72%. Poco a poco se congelan a -80 ° C utilizando un lento-freezing contenedor para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 ° C / min, antes de transferir a nitrógeno líquido.

2. La infección de ratones experimentales

1. Coloque el CD1 ratones hembra (~ 21-25 g) en una caja de calentamiento para calentar suavemente para dilatar las venas. Coloque los ratones calentado en un sistema de retención de plástico e inyectar 0,2 ml de inóculo diluido por vía intravenosa con una aguja de 25 G en la vena caudal, equivalente a 4.000 tripanosomas por ratón. Colocar presión en el sitio de la inyección después de detener la hemorragia.
   Nota: la infección intraperitoneal es una ruta válida de la infección y se ha utilizado en estudios previos ^10, pero hemos hallado que este menos reproducible que la vía intravenosa.
2. Selección aleatoria de los ratones infectados y la jaula en grupos de 3 en jaulas ventiladas SPF. Como control, se inyectan ratones hembra CD1 de tipo salvaje con parásito no bioluminiscente, T. segundo. brucei GVR35 (n =3).
3. Monitorear la infección a través del cine Microscopía de Sangre
   1. Spot 5 l de sangre de la punción venosa o sangrías en un portaobjetos de vidrio y realizar un frotis de sangre (utilizando una segunda lámina de vidrio empuje suavemente la gota de sangre a través de la corredera para producir una película delgada). Permitir que las diapositivas se sequen al aire.
   2. Fijar la muestra de sangre con metanol al 100% y tinción con Giemsa durante 10 minutos antes de enjuagar con _H2O destilada y dejar secar al aire. En el objetivo 100X contar el número de tripanosomas en 10 campos de visión (FOV).
      Nota: la filmación de la sangre se lleva a cabo junto con imágenes no invasivo animal entero tan pronto como un día después de la infección. Cuando se procesa un número de animales, se prefiere este método de cuantificación tripanosoma sobre conteo hemocitómetro que las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente y se contaron después.

3. La bioluminiscencia de imágenes para realizar el seguimiento de Infecciones

Nota: Para controlar la infección, toda animde formación de imágenes al no invasiva se puede utilizar.

1. Preparar una solución madre de D-luciferina, el sustrato de luciferasa de luciérnaga, en Dulbecco salina tamponada con fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar y congelar en alícuotas a -20 ° C.
   Nota: D-luciferina es sensible a la luz, por lo tanto, protegerlo de la luz envolviendo alícuotas en papel de aluminio. No congelar y descongelar repetidamente luciferina, ya que puede afectar a la actividad ^11.
2. Calentar una alícuota de D-luciferina a temperatura ambiente. Retirar cada ratón de la jaula (incluyendo los ratones de control infectados con nonbioluminescent cepa del parásito de tipo salvaje) e inyectar 150 mg / kg de la D-luciferina calentado (diluido en DPBS) por vía intraperitoneal con una aguja 25 G. Coloque los ratones en una cámara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para inducir la anestesia con isofluorano al 2% / O ₂ mezcla a 2,5 L / min.
   Nota: Los ratones se vuelven inmóviles cuando están bajo anestesia. Para el generador de imágenes se utiliza aquí, 3 ratones pueden ser procesados ​​a la vez. Si los ratones son anesthetracterizado por más de 30 min, oftálmica ungüento lágrima artificial se puede aplicar a evitar que los ojos de los ratones de la desecación.
3. Para el generador de imágenes se describe aquí, abra el software e inicializar la máquina utilizando el software según las instrucciones del fabricante. Adquirir imágenes una vez que la cámara y placa calentada han alcanzado la temperatura.
   Nota: Este instrumento no está normalmente apagado, permitiendo a la máquina para realizar las calibraciones de fondo durante la noche. En el caso de que se debe reiniciarse, se debe realizar una verificación de la calibración en primer lugar.
4. Coloque los ratones anestesiados en el generador de imágenes (véase 3.5). Utilice separadores negros grandes entre los ratones para minimizar sangrar a través de cualquier señal bioluminiscente brillante. los ratones de imagen utilizando un conjunto de tiempos de exposición; 1, 3, 10, 30, 60 y 180 segundos, con binning medio, 1 f / stop y un filtro abierto, y el campo visual E (12,5 x 12,5 cm ^2).
   Nota: Los ratones de control infectados con los parásitos de tipo salvaje GVR35 nonbioluminescent proporcionan un backgrvalor bioluminiscencia ound. Desde un experimento de cinética de luciferina (Figura 6) con este modelo, hemos encontrado que los picos de señal de bioluminiscencia en 10 minutos después de la administración y de formación de imágenes se lleva a aproximadamente 5 min para 3 ratones. Tome esta escala de tiempo en la consideración al anestesiar y imágenes de los ratones.
5. Para asegurar la formación de imágenes a fondo de los ratones, girar para obtener un ventral, dorsal y lateral. Mantener la coherencia en el orden de orientación para formación de imágenes entre los animales secuenciales.
6. Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia bajo observación antes de volver a SPF-jaula.
7. Continuar la formación de imágenes ratones cada 7 días hasta el día 21 después de la infección. Debe haber un aumento constante de la señal de la bioluminiscencia durante todo el animal.
8. En D21, imagen y frotis de sangre de los ratones como se describió anteriormente, y la dosis de los ratones con 40 mg / kg por vía intraperitoneal diminazeno aceturato. Este fármaco se borrará la parasitemia periférica, pero no va a cruzar la barrera sangre-Brain barrera, y por lo tanto permite una mejor visualización de la infección del SNC.
   Nota: diminazeno aceturato es un fármaco bien establecido utilizado para tratar las primeras etapas de la tripanosomiasis animal.
9. Continuar imágenes y controlarse en D28 y D35.

4. Confirmación de la infección del SNC

1. En D35, los ratones de imagen indicados anteriormente (pasos 3.1-3.4).
2. Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia y ratones Exsanguinate como se detalla en el paso 1.6 hasta 1.8, la recogida de sangre para su posterior análisis.
3. Después de punción cardíaca, perfundir los ratones con 20 ml de PBS (opcional: añadir 3 mg / ml de luciferina para solución de perfusión) a través del corazón para limpiar la sangre de los órganos y de volver a introducir la etiqueta luciferina que podrían haber desaparecido de la región del cerebro durante el intervalo de tiempo desde el paso 4.1.
4. eliminar suavemente el cerebro, mediante el uso de tijeras curvas, el corte de la base alrededor de la circunferencia del cráneo, y el levantamiento de la parte superior del cráneo, para permitir que el cerebropara ser levantado suavemente con fórceps curvos.
5. Coloque el cerebro extirpado en una sección de plástico negro y pipeta de 50 l de 15 mg / ml de luciferina sobre el órgano antes de la imagen, para asegurar luciferina adecuada se ha añadido al cerebro extirpado. Imagen utilizando la configuración que el anterior. Esto demostrará la localización de la infección a los hemisferios cerebrales.
   Nota: cuantificación Aguas abajo de parasitemia en el cerebro extirpado se puede llevar a cabo por qPCR como se describió previamente ^8. Otras aplicaciones posteriores alternativas podrían incluir la histología o inmunohistoquímica para identificar los parásitos en el tejido cerebral después de la fijación.

5. La cuantificación de la bioluminiscencia Imaging

Nota: La bioluminiscencia se puede cuantificar utilizando la región de interés (ROI) con el software de imágenes y corregida para el fondo bioluminiscencia.

1. Con la herramienta de retorno de la inversión, crear un ROI rectangular para la cuantificación de un animal enterond posicionarlo la imagen del ratón sobre para cubrir la punta de la nariz a la base de la cola del ratón. Utilice el mismo cuadro de tamaño para cada animal y cada punto de tiempo. Al mirar el retorno de la inversión para el cerebro, utilizar un ROI circular de la misma manera, el posicionamiento por encima de la región de la cabeza del ratón en la imagen.
2. Si se desea, ajustar las imágenes a aparecer en el mismo espectro de una representación visual de la infección.
   Nota: El software utilizado aquí genera un mapa de colores para cada imagen se ajusta automáticamente para el recuento mínimo y máximo de fotones. Para permitir la comparación visual entre una serie de imágenes, la escala de color debe estar ajustado a los mismos valores para todas las imágenes.
   1. El uso de la imagen de mayor bioluminiscencia y la pestaña 'Ajuste de imagen "en la paleta de herramientas, seleccione una escala logarítmica y un mínimo de la escala de color adecuado y la máxima (a determinar empíricamente). Aplicar esta escala para todas las imágenes a lo largo del experimento.

Resultados

Este protocolo demuestra cómo seguir la progresión de la enfermedad después de la infección de ratones con T. segundo. brucei, un modelo para la tripanosomiasis africana humana. La Figura 1 muestra la línea de tiempo del protocolo experimental, lo que demuestra el calendario de tratamiento de imágenes y pasos. La figura 2 muestra un campo típico de vista en un frotis de sangre teñido con Giemsa fija que se utiliza para cuantificar la par...

Discusión

El desarrollo de un T. bioluminiscente segundo. brucei cepa GVR35 permite la visualización de una infección por tripanosoma de principios a la etapa tardía. Modelos de infección anteriores eran incapaces de detectar la fase de retraso, cuando los parásitos están en el cerebro, en tiempo real desde la microscopía de frotis de sangre, y requieren el sacrificio y la eliminación de los cerebros de los ratones infectados para determinar la carga parasitaria ^12. La bioluminiscencia reduce ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model