분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

요약

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

초록

체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.

서문

B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC ^(1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 ² 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-) 나이브 B 세포 ^{(- -} CD38 CD19 ⁺ CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 ⁺ CD27 ⁺ IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 ⁵ 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 ⁺ 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 ⁺ PB들 / PC를 ^6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 ^{4-7 이질성을} 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 ⁸ CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 ^9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 ^{(6), 11-15에} 위치 할 때 십일 - 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 ^(6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / ⁶ PC의 ^순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다.

지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 ^(16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) - 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 ^(17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다.

ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 ^{17 ~ 18에서} 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 ^19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.

프로토콜

인간의 말초 혈액은 동의서에서 건강한 기증자로부터 얻을 수 있어야하며, 혈액 샘플의 사용은 개별 기관 생명 윤리위원회에 의해 설립 승인 가이드 라인을 준수해야합니다. 본 연구에서는 프로토콜은 국립 대만 대학 병원의 내부 검토위원회 (프로토콜 번호 201307019RINB)에 의해 승인되었다 유동 세포 계측법 (그림 1)과 ELISPOT 분석 (그림 3)의 결과의 데모 인간의 혈액을 사용합니다.

1. 분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화

1. K ₂ EDTA (1.5-2.0 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 15 ML의 튜브로 (팔꿈치에 cubital 포사 앞쪽에) 중간 cubital 정맥에서 혈액 ~ 10 ㎖를 그리고 즉시 튜브를 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전 형성.
2. 적혈구가 (RBC)의 버퍼 (150 mM의 NH ₄ CL, 10 mM의 KHCO _3, 1 mM의 EDTA를 용해 (121 ° C, 15 분) 오토 클레이브의 35 mL를 넣고, 페이지신선한 혈액 샘플 (≥ 3 함유 튜브 H 7.4) : 1 부피 / 부피)을 더 이상 5 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
   주 : 튜브를 통해 빛의 전송의 모양은 RBC 용해의 완료를 나타냅니다.
3. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 펠렛 색 흰색 있는지 확인하십시오.
4. 10 멸균 된 인산 완충 식염수 mL로 펠렛을 재현 탁 (PBS, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.47 mM의 KH ₂ PO _4, 산도 7.4) 단계 1.3에서와 같이 원심 분리기.
5. 상등액을 버리고 ㎖의 RPMI 1640 배지 (첨가제 : 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 2 mM L- 글루타민) 10 펠렛을 재현 탁 다음과는 판형 10 cm 배양 접시에 세포 (접시 당 혈액 10 ㎖). 30 분 동안 5 % CO _2와 37 °의 C 배양기에서 접시를 놓습니다.
6. 조심스럽게 배양 접시를 몇 번 소용돌이 및 배치15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 배지 (서스펜션 세포). 배양 접시에 부착 세포 (주로 대 식세포)를 폐기하십시오.
7. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
8. RPMI 1640 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 혈구 또는 자동 셀 카운터 셀 수를 계산합니다.
   주 : 절연 백혈구의 생존 정상적으로 트리 판 블루 배제에 의해 90 %보다 크다.
9. 단계 1.7에서와 같이 원심 분리기 (5)의 농도로 차가운 PBS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA)의 ~ 200 μL의 세포를 재현 탁 - 10 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖.
10. ¹⁰⁶ 세포 당 (B 세포를 음성 선별 용) 혈액 세포에 특정 비오틴 화 항 - 인간 구간 칵테일 5 μL를 넣고, 30 분 ²¹ 얼음 위에서 배양한다.
    참고 : 항 - 인간 Ab의 칵테일은 적어도 CD2 (또는 CD3), CD14 및 CD16 특정 애비를 포함해야합니다.
11. 10 배를 초과하는 볼륨 추가멸균 PBS의 세포를 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하고, 상등액을 폐기한다.
12. 동일 스트렙 타비 딘 - 복합 마이크로 비드의 양 펠릿에 (10 ⁶ 세포 당 5 μL)을 추가하고 철저하게 섞는다.
13. 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에서 30 분 동안 얼음에 품어.
14. 튜브에 PBS 버퍼 2 ML을 추가합니다.
15. 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 8 분 동안 실온에서 품어. 갈색 마이크로 비드 서서히 옆의 자석 ^(22)에 튜브 벽에 부착된다.
16. 자기 스탠드에 남아있는 관으로, 조심스럽게 새로운 멸균 15 ML의 튜브 ^(22)에 뜨는을 전송합니다.
17. 반복 1.16-1.14 단계를하고, 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층 액을 결합한다. 마이크로 비드를 폐기하십시오.
18. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
19. 하류 실험 RPMI 1640 배지에 펠렛을 재현 탁.
    참고 : 일반적으로 1-5 × 10 ⁵ B 세포의 지혜HA 말초 혈액 10 mL의 95 % 이상의 순도가 ^23을 분리 할 수있다.

격리 된 B 세포 2. 정제 및 메모리의 분리 및 나이브 B 세포

1. 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다.
2. 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리 및 RT 후 차가운 PBS 완충액 100 μL의 세포를 재현 탁.
3. 추가 1 - 10 ⁶ 세포 당 바이오틴 CD27 단클론 항체 μg의 2를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
4. 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기에 PBS 버퍼의 10 ML을 추가합니다.
5. 뜨는을 취소하고 PBS 버퍼 50 μL의 세포를 재현 탁.
6. 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 세포 - (2 μg의 / 10 ⁶ 세포 1) 스트렙 타비 딘 자기 마이크로 비즈의 동일한 금액을 추가합니다.
7. 부드럽게 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
8. 튜브에 PBS 버퍼의 3 mL의 - (2)를 추가합니다.
9. 놓고자기 스탠드에 관하고 갈색 마이크로 비드를 자석에 가까운 측에 부착 할 수 있도록 8 분 동안 RT에서 배양한다.
10. 자기 받침대의 관을 조심스럽게 새로운 멸균 튜브로 상청액 분획을 전송. 순진한 B 세포 ^-이 부분은 풍부한 CD27가 포함되어 있습니다.
11. 마이크로 비드를 포함하는 튜브에 5 mL를 추가하고 부드럽게 마이크로 비드를 재현 탁 (즉, CD27 ⁺ 메모리 B 세포의 농축 비율) ^{24 ~ 25.}
12. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 하류 실험 RPMI 1640 배지와 펠렛을 재현 탁.
    주 : 일반적으로, ~ 30 - B 세포의 60 %는 건강한 공여체 ^{(7), 25-26의} 한 PBMC로부터의 CD27 ^{+ 메모리} 셀들로 정제 할 수있다.

나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 /의 PC의 컬렉션에 대한 정렬 3. 셀

1. 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하는 hemocytome를 이용하여 세포 수를 결정터 또는 자동 세포 계수기.
2. 5 mL의 폴리스티렌 튜브에서 ¹⁰⁷ mL 당 농도에 차가운 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁.
3. 1 추가 - 10 ⁶ 셀 당 인간 IgG의 2 μg의 및은 FC 블록 10 분 동안 얼음에 품어.
4. 1 μg의 각 추가 항 CD19를-APC (클론 : HIB19), 항 CD27-eFluor450 (클론 : O323), 및 항 CD38-PE (클론 : HIT2) 10 ⁶ 세포 당; 잘 혼합하고 30 분 ^{4, 27} 얼음에 품어.
5. 단계 3.4의 마지막 5 분에서, 상업 7 aminoactinomycin의 D (7-AAD)의 5 μL를 추가합니다.
6. 5 분 동안 600 XG에 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 PBS의 2 ML을 추가합니다.
7. 15 ㎖의 튜브 용액 당 5 × ¹⁰⁷ 세포 - 1의 농도 (2 % BSA, 2 mM의 EDTA로 멸균 PBS) 정렬 버퍼에 세포를 재현 탁.
8. 세포 덩어리를 제거하기 위해 나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 ㎛의 공극 크기)를 통해 세포를 필터.
9. 유동 세포 계측 정렬하여 세포를 분리바이올렛 (405 ㎚), 청색 (488 nm의)과 빨간색 (640 ㎚) : 어 세 가지 레이저를 장착.
   참고 : 3 색이 세포 계측법 ^27-28 흐름을 위해 혼자 블루 레이저 충분하다.
10. 정렬 세 나이브 B 세포의 동시 수집을 위해 (5 ㎖ RPMI 매질 포함) 15-㎖의 튜브 (CD19 ⁺ CD27 ^-)로 세포, 기억 세포 (CD19 ⁺ CD27 ⁺⁾ 및 PB들 / PC를 (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / 하이} CD38의 ^{+) 3-4, 28.}
    주의 : 단계 4에 기재된 바와 같이 분류 및 나이브 기억 B 세포를 배양 할 수있다.

나이브 B 세포 ^- 고립 ^된 인간의 CD19 ⁺ B 세포, CD19 ⁺ CD27 ⁺ 메모리 B 세포와 CD19 ⁺ CD27의 체외 분화 4.

1. 단계 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10로 정제하여 세포를 이용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 결정한다.
2. RPMI 1640 배지로 세포를 재현 탁1의 농도에서 -는 ml 당 10 × ^105은 12 웰 플레이트로 나누어지는.
3. / mL의 ^{18, 29} 5 μg의 / 10 ⁶ 세포에서의 CpG (ODN 2006)를 추가합니다.
4. 배양 5 일간 5 % CO _2, 37 ° C의 배양기에서 세포.
5. 물론 각각의 세포를 수확 15 ML의 튜브에 개별적으로 배치, 각 튜브에 PBS의 5 mL를 넣어 5 분 동안 600 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
6. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. RPMI 1640 배지로 용액에 10 × ¹⁰⁵ - (1)의 농도로 세포를 재현 탁.

5. ELISPOT 분석

1. 30 초 동안 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 증류수 35 % 에탄올의 30 μL를 추가한다.
   참고 : 피펫 팅 할 때, 항상 우물에서 막를 만지지 마십시오.
2. 에탄올을 제거하기 위해 ELISPOT 판을 반전.
3. 각 웰에 150 μL 멸균 DDH ₂ O의 넣고 배양5 분간 RT에서 그들을 잔류 에탄올을 세척하는 단계; 3 분 동안 실온에서 멸균 PBS의 세척에 따릅니다.
   참고 : 5.3-5.1이 판의 제조에 따라 선택 될 수있다 단계.
4. 넣어 5 μg의 / mL의 클론 F (AB ') 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 ₂ 조각 50 μL 4 ° C에서 하룻밤을 품어 (PBS로) ELISPOT 플레이트의 각 웰에와 (선호) 또는 2 시간 ¹¹ 37 ° C를.
   참고 : 사용할 때까지 파라 필름과 판의 가장자리를 밀봉합니다.
5. 3 분마다 RT에서 두 번, 언 바운드 복근을 제거 각 웰에 PBS 200 μL를 추가하고,이를 배양 접시를 반전.
6. 잘 차단 각각 5 % BSA (또는 RPMI 1640 배지)를 PBS 200 μL를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 이들을 배양한다.
7. 차단 버퍼를 제거하기 위해 번호판을 반전. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
8. 각 웰에 RPMI 1640 배지 100 μL를 추가하고 37 ° C에서 그들을 품어.
9. 준비된 세포를 시드하는 경우, RPMI 1640 배지를 제거하기 위해 반전 플레이트.
10. 종자 100 μL (5 × ¹⁰⁴⁾ 50 μL (2.5 × ^104)과의 웰에 25 μL의 셀 (1.25 × ¹⁰⁴⁾ (단계 1.19, 2.10, 2.11, 3.10에서 4.6) ELISPOT 판. RPMI 1640 배지로, / 잘 150 μL에 볼륨을 가지고.
    참고 : 세포를 도금 하나 또는 두 개의 2 배 연속 희석의 최소 권장합니다.
11. 14 시간 ^18-8 5 % CO _2와 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 중에 플레이트를 이동하지 마십시오.
12. 세포 및 RPMI 1640 배지를 제거하는 번호판을 반전.
13. 3 분 동안 실온에서 때마다 5 회 (0.05 % 트윈 20과 PBS) 200 μL / 잘 PBS-T의를 추가하고 그들에게 품어. 5 회 세척 각 사이의 세척 완충액을 제거하기 위해 판을 전환.
14. 염소 항 - 인간 IgG-알칼리성 포스파타제 (AP), Fcγ 특정 애비를 추가 (IgG를 감지, 1 : 5,000 PBS-T에서) 또는 염소 항 - 인간 IgM의-AP, Fcμ 단편 특정 애비 (IgM의 검출, 1 : PBS-T 5,000) 지정된 우물에와 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
15. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
16. 50 μL / 웰의 bromochloroindolyl 인산 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT) 기질 용액을 추가합니다. 15 분 - 퍼플 색의 반점은 보통 5에 나타납니다.
17. 관광 명소의 과도한 개발을 방지하기 위해 100 μL / 잘 DDH ₂ O를 추가합니다.
18. 모든 지점의 전체 개발 후 수돗물을 실행하는 접시를 씻어.
19. 판의 암거를 제거하고 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다.
20. 이미지 획득 / 분석 부 (예를 들면, 자동 또는 수동으로 스캐너 해부 현미경을 통해)로 자동 플레이트 판독기를 사용하여 스폿을 카운트.
    주 : 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 저장하고 나중에 분석 될 수있다.

결과

PBMC를이 적혈구 및 부착 세포 (1.7-1.2 단계)의 고갈되었다. 세포의 분취 량 (2 × ^106)의 말초 혈 (도 1)의 B 나이브 세포, 메모리 B 세포, PBS를 / PC를 모집단을 설명하기 위해 유세포 분석을 행 하였다. 이 공여자의 PBMC를, 상기 림프구의 약 10 %가 CD19 ⁺ B 세포이다. ㄴ 세포 구획에서 CD19 ⁺ CD27의 비율 ^- 나이브 B 세포는 약 50 %였다. 한편, ...

토론

분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화

일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다.

산 스트...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 mL Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.