フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

要約

この原稿は、表現型とフローサイトメトリーによるラット腎臓からの常駐マクロファージの定量分析のための詳細なプロトコルを記述しています。得られた染色された細胞はまた、このように実験モデルで得られた情報を増加させる、細胞選別、遺伝子発現分析または機能的研究を含む他の用途に使用することができます。

要約

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

概要

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

プロトコル

このプロトコルは、指令欧州議会の63分の2010 / EUと国家ガイドライン2013分の53以下のローカル施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

試薬およびソリューションの作製

1. 無菌条件下で全ての試薬と解決策を準備し、層流フードの下で使用しています。 4℃でのソリューションをしてください。
2. 染色バッファー（1×ダルベッコPBS中の2％ウシ胎児血清（FBS））を準備します。
3. 生理食塩水の各mlにコラゲナーゼ0.5mgのを追加することで、コラゲナーゼ溶液を準備します。
4. （2：1 v / v）をケタミン/キシラジン麻酔の溶液を調製します。

2.腎臓灌流および抽出

1. ケタミン/キシラジン（75mgの/ 12ミリグラム/キログラム体重）の腹腔内注射により、ラットを麻酔。慎重に動物が十分に麻酔されていることを確認するために、皮膚の小さな倍をつまみます。その後、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、獣医軟膏で目をカバーしています。注：4月第齢のWistarラットを、このアッセイで使用されています。
2. ラットが完全に麻酔された後、仰臥位で手術台の上に置きます。
3. 腹部に70％エタノールを適用します。
4. 胸膜および腹腔を露出させるために、恥骨から胸郭に、腹部皮膚及び腹膜を介して中央切開を行います。
5. 全ての血液は腎臓から除去されるまで灌流システムを使用して腎臓を灌流するために腹部大動脈に生理食塩水（0.9％）を注入します。血液を解放するために役立つ腹部レベルで大動脈をカットします。
6. 腎門部（腎静脈、動脈および尿管）から切断することにより、ラットから両方の腎臓を削除してください。腎臓をデカプセル化するには、慎重にカプセル^11を分離^し 、指を使って腎臓の端を押してください。
7. ハンクス平衡塩溶液中に腎臓を置きます。

3.腎消化し、細胞懸濁液

1. 小片にハサミで腎臓の半分をカットして入れて1.5mlチューブに個。
   注：すべての次の濃度は、1サンプル（1/2ラットの腎臓）のために計算されています。
2. コラゲナーゼ溶液1mlを加え、37℃で30分間インキュベートします。コラゲナーゼ溶液は、組織全体にアクセスすることを確認するために、5分毎に転倒混和します。
3. ソリューションを収集し、プランジャーの助けを借りて、ストレーナ（40ミクロン）に通し、そして染色緩衝液10mlでそれを再懸濁します。
4. 15分間400×gで遠心分離します。
5. 1ミリリットルACK（塩化アンモニウムカリウム）ライジングバッファーでペレットを再懸濁します。室温で1分30秒後に、反応を停止する染色緩衝液10mlを加えます。
6. 10分間400×gで遠心分離します。
7. 再懸濁染色緩衝液（1ミリリットル）の十分なボリュームでペレットをストレーナ（30μm）を用いて、細胞懸濁液をフィルタリングします。
8. 血球計数器で、トリパンブルー排除を用いて細胞の数をカウントし、STA用1.5mlチューブに200万セルを追加ining。

4.細胞染色およびフローサイトメトリー分析

1. 5分間100×gで遠心分離した細胞。
2. Fc受容体をブロックするために4℃で10分間：ラット血清を100μlでペレットを再懸濁（100 1希釈）。
3. 5分間染色緩衝液および遠心分離100×gでの1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
4. 生細胞（：千3）を検出すると、ソリューションCD45 APC-Cy7の（1：：：100）、CD163 A647（100 4）各条件のための染色緩衝液100μlの細胞表面染色のための抗体を混ぜます。
5. 暗所で4℃で20分間、抗体混合物で細胞ペレットを再懸濁します。
6. 5分間100×gで染色緩衝液遠心分離機を1ml添加することにより洗浄します。この手順を繰り返します。
7. 暗所で4℃で20分間固定/透過処理溶液を600μlのを追加します。
8. 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で2回洗浄します。
9. intracelのために：CD68 FITC抗体（千35）を追加各条件のための透過化/洗浄バッファー100μlにlular染色。
10. CD68抗体溶液中でペレットを再懸濁し、暗所で4℃で50分間インキュベートします。
11. 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で洗浄します。
12. 再懸濁、透過化/洗浄バッファー100μlでペレットをCD86PE抗体（35：1,000）を追加し、暗所で4℃で20分間インキュベートします。
13. 5分間、100×gで透過化/洗浄緩衝液および遠心機の1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
14. 透過化/洗浄バッファー100μlでペレットを再懸濁し、チューブ、フローサイトメトリーに渡します。
15. フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。側方散乱光/前方散乱光（SSC / FSC）ウィンドウにゲーテッド生細胞におけるCD45染色を決定します。第2段階では、CD68 ⁺細胞におけるCD86およびCD163発現を分析。

結果

私たちは、腎臓に浸潤マクロファージの存在の増加に関連した腎障害の炎症実験モデルにおけるマクロファージの不均一性を分析しました。以前に¹²報告されているように、このモデルでは、腎臓の損傷は、Wistarラットでの3週間の飲料水中アルドステロン（1ミリグラム^-1キロ^-1日）に加えて、塩（塩化ナトリウム1％）の投与によって誘発しま?...

ディスカッション

マクロファージは、腎疾患を含む種々の炎症性疾患において重要な役割を果たしている異種の細胞です。糸球体腎炎、糖尿病性腎症や腎がん^14-16で報告されているように、各マクロファージ亜集団は、腎障害の開発に異なる方法で寄与するため、腎疾患におけるマクロファージのサブセットの特性評価への関心が高まっています。急性腎損傷の初期段階では、M1マクロファージの優位?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000