Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Resumen

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Resumen

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Introducción

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protocolo

Nota: Los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. incubadoras de temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de mosca y cruces a menos que se indique lo contrario.

1. Preparativos

1. Preparar moscas.
   1. Prometafase enriquecido con colecciones de ovocitos.
      1. Claro moscas adultas jóvenes a partir de valores o transversales cultivos sanos,. botellas de edad para los dos días a 25 ° C.
         NOTA: Por lo general dos botellas sanas serán suficientes, aunque más pueden ser necesarios para algunas culturas cruzadas.
      2. Después de dos días, recoger ~ 100 a 300 mujeres (que son de 0 a 2 días de edad en este punto) de las botellas. Las hembras no tienen que ser vírgenes. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar 30 hembras y 10 machos y 15 cada uno en los viales yeasted. viales de edad para los dos días a 25 ° C.
   2. Metafase-enriquecido ovocitos Colecciones.
      1. Recoger ~ 100 a 300 hembras de valores o cruz culturES. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar cada 30 hembras (sin machos añadidos) en los viales yeasted. viales de edad para los tres a cinco días a 25 ° C.
2. Preparar soluciones.
   Nota: Las soluciones se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
   1. Prepárese Modificado Buffer de Robb (5x): mM HEPES 500, sacarosa 500 mM, acetato de sodio 275 mM, acetato de potasio 200 mM, glucosa 50 mM, cloruro de magnesio 6 mM, y cloruro de calcio 5 mM. Utilice 10 N 11: 8 de hidróxido de sodio: hidróxido de potasio para llevar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración; No esterilizar en autoclave. Almacenar a -20 ° C. Descongelar según sea necesario para preparar ~ 200 ml de 1x de Robb por oocito de preparación.
   2. Soluciones de fijación.
      1. Opción # 1: Preparar la fijación de formaldehído / heptano. Preparar Fijación Buffer: solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) más sacarosa 150 mM. Para utilizar, hacer fresco con 687,5 l Fijación de amortiguamiento y 312,5 l 16% de formaldehídopor la preparación de los ovocitos.
         PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formaldehído en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales.
      2. Opción # 2: Preparar la fijación de formaldehído / cacodilato. Preparar la mezcla Fix: sacarosa 250 mM, 100 mM de acetato de potasio (pH 7,5), acetato de sodio 25 mM (pH 7,0), y EGTA 25 mM (pH 8,0). Para utilizar, hacen fresco con 400 l Fix Mix, 100 l de cacodilato de potasio (1 M, pH 7,2), y 500 l 16% de formaldehído por la preparación de los ovocitos.
         PRECAUCIÓN: cacodilato de potasio contiene arsénico.
   3. Preparar PBS / Triton X-100: 1x PBS más 1% o 0,05% de Triton X-100. Almacenar a 4 ° C.
   4. Preparar PBS-Tween 20-albúmina de suero bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v), y 0,1% de Tween-20. Puede ser almacenado a 4 ° C durante una semana.
   5. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Soluciones.
      1. Preparar cloruro de sodio-20X citrato de sodio (SSC): cloruro de sodio 3 M y citrato de sodio 0,3 M.
      2. Preparar 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC más 0,1% de Tween-20. Hacer frescas, ~ 20 ml por la preparación de los ovocitos.
      3. Preparar soluciones de formamida: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, además de formamida. Hacer fresca, 1 ml 20% de formamida, 0,5 ml 40% de formamida, y 2 ml 50% de formamida por prep ovocito.
         PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formamida en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales.
      4. Preparar la solución de hibridación: 2 x SSC, formamida al 50%, y 10% de sulfato de dextrano (w / v). Almacenar a 4 ° C.
   6. Las sondas FISH.
      1. Oligonucleótidos orden (véase la Tabla 1 para las secuencias) con la purificación por HPLC y la deseada 5 'modificación fluorescente (por ejemplo, Cy3 o Cy5). Resuspender en tampón Tris-EDTA (TE) a 50 ng / l.
         NOTA: Proteja oligos de exposición a la luz en todo momento.

2. Recolección de etapa tardía de Drosophila ovocitos

1. Como ovocitos Drosophila con membranas intactas se pegue a plástico y vidrio, pre-recubrir el interior de un tubo de 5 ml y una pipeta Pasteur por prep ovocito con PTB.
2. Anestesiar a todos ~ 100 a 300 moscas yeasted con dióxido de carbono y añadir a un mezclador que contenía ~ 100 ml 1x Buffer de Robb. Pulso tres veces (~ 1 seg cada uno). Mantener en ovocitos de Robb para <20 min para evitar la activación.
   NOTA: Como alternativa, los ovocitos pueden ser a mano disecados de las hembras. La ventaja de este método es que requiere menos hembras. Sin embargo, se debe tener cuidado para limitar la exposición a dióxido de carbono a unos pocos minutos para evitar artefactos asociados con la hipoxia ^7.
3. Se filtra a través de malla grande (~ 1.500 m) en 250 ml vaso de precipitados para eliminar grandes partes del cuerpo. Si muchos abdómenes intactos permanecen en material de malla, re-molienda usando tampón adicional de Robb, y el filtro de nuevo. Dejar reposar ~ 2 min, luego aspirar fuera de la capa superior, la eliminación de la mayor cantidad de grandes partes del cuerpo como sea posible.
4. Fifiltro a través de malla pequeña (~ 300 micras) en un vaso de precipitados de 250 ml. Enjuague ovocitos restantes de cada primer vaso de precipitados utilizando adicional de Robb y recubiertos pipeta Pasteur. Dejar reposar ~ 3 min; ovocitos se asentarán. Aspirar todos, pero ~ 10 ml.
5. Verter la mayor cantidad de 10 ml como se ajusta a revestida tubo de 5 ml. Dejar reposar, remover el líquido, y repetir con residuo. Enjuague oocitos restantes de vaso de precipitados utilizando adicional pipeta Pasteur de Robb y revestido. Deje asentarse en 5 ml tubo por unos 3-5 minutos.

3. Tratamientos farmacológicos (Opcional)

1. Escudo un segundo tubo de 5 ml con PTB para cada preparación de los ovocitos. Añadir disolvente apropiado (control) o el medicamento a 1 ml de Robb cada uno para cada preparación de ovocitos (Tabla 2).
2. ovocitos divididos en un segundo tubo recubierto de 5 ml. Dejar reposar, eliminar el líquido, y añadir 1 ml de Robb más disolvente en un tubo y 1 ml de Robb más fármaco en segundo tubo. Inclinar la cabeza para la cantidad de tiempo apropiado para el tratamiento de drogas (Tabla 2). Let asiente.

4. Fijación

1. Aspirar todo el líquido e inmediatamente añadir 1 ml Fix.
2. Opción # 1: El formaldehído / heptano fijación (fijación de búfer más el 5% de formaldehído).
   1. Fijar durante 2,5 minutos en un nutator. Añadir 1 ml de heptano y agitar 1 min. Dejar reposar ~ 1 min.
   2. Eliminar todo el líquido, y luego agregar 1 ml de PBS 1x. Vortex 30 seg. Dejar reposar ~ 1 min.
   3. Eliminar todo el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x.
      NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.
3. Opción # 2: la fijación de formaldehído / cacodilato (Fix Mix Plus 8% de formaldehído y cacodilato 100 mM).
   1. Fijar durante 6 minutos en un nutator. Dejar reposar 2 min. Retire el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x.
      NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.

5. Extracción de Membranas ( "Rolling")

1. Usando recubierto pipeta Pasteur, añadir ~ 500 a 1000 ovocitos a la parte esmerilado (chorro de arena) de un portaobjetos de vidrio. Retirar todas las partes del cuerpo y materiales extraños con unas pinzas. No deje que se sequen los ovocitos; añadir 1x PBS como sea necesario.
2. Colocar un cubreobjetos en la parte superior de los ovocitos y suavemente ovocitos "rollo" hasta que todas las membranas se retiran (arrastrando el borde del cubreobjetos a través de los ovocitos que funciona mejor.) Controlar periódicamente el progreso bajo el microscopio, la adición de más 1x PBS como sea necesario. Tenga cuidado puesto que demasiada presión va a destruir los ovocitos.
   NOTA: Por inmunofluorescencia solamente, continúe con el paso 6. Para los peces (con o sin inmunofluorescencia), continúe con el paso 7.

6. Anticuerpo La tinción de Drosophila ovocitos

1. Extracción y bloqueo
   1. Enjuague ovocitos enrollado en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ~ ml de PBS / 1% de Triton X-100. ovocitos inclinar la cabeza en esta solución durante no menos de 1,5 horas y no más de 2 horas.Este paso permite la penetración de anticuerpos.
   2. Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Retire el líquido junto con el mayor número de membranas como sea posible, a continuación, añadir PBS / 0,05% de Triton X-100.
      NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados.
   3. Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 minutos, luego retire todos menos ~ 1 ml de líquido. ovocitos de transferencia a graduaron tubo de 1,5 ml y eliminar el líquido residual. Añadir 1 ml PTB para el bloqueo y inclinar la cabeza durante 1 hora.
2. La tinción de anticuerpos
   1. Pre-absorción de anticuerpos secundarios contra embriones.
      NOTA: Este paso elimina la tinción de fondo de las interacciones de anticuerpos no específicos con proteínas de Drosophila.
      1. Recoger y fijar embriones de Drosophila (~ 25 l) por procedimiento típico ^8. Almacenar en metanol a -20 ° C.
      2. Eliminar el metanol a partir de embriones, añadir 800 l de metanol más 200 l de 1x PBS, y inclinar la cabeza durante 15 minutos. Retire 500 l de sobrenadante y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Luego inclinar la cabeza durante 15 minutos. Repetir dos veces (para un total de ~ 1 hr de lavados), y luego terminar en el PTB.
         NOTA: Los embriones se puede usar inmediatamente o mantenerse en el nutator para varias horas a temperatura ambiente.
      3. Retire el líquido, se llenan de PTB a 200 l por la preparación de los ovocitos, y añadir anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a las diluciones apropiadas (teniendo en cuenta que el volumen final será de 300 l;. Véase el paso 7.4) titubear a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h.
         NOTA: Los anticuerpos pre-absorción se utilizó en el paso 6.2.4.
         NOTA: Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido.
   2. Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir anticuerpos primarios en diluciones adecuadas. Inclinar la cabeza a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h.
   3. Lavar los ovocitos cuatro veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB.
   4. retirarlíquido de ovocitos, añadir 200 l de sobrenadante a partir de embriones (pre-absorción anticuerpos secundarios). Luego llene con PTB para 300 l. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 3-4 h (preferible) o a 4 ° C durante la noche.
   5. Lavar los ovocitos de una vez por 15 min con 1 ml PTB, eliminar el líquido. A continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos.
   6. Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB.
      NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento de formación de imágenes.

7. FISH (Continúe desde el paso 5 anterior)

1. Enjuague ovocitos enrollados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ml ~ 2x ECSS. Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Deje únicamente ~ 0,5 ml de líquido junto con el mayor número posible de las membranas.
   NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados.
2. Transferencia de ovocitos a 0,5 ml tubo y remover el líquido remanente. Sucesivamente añadir y eliminar 500 l20%, 40%, y 50% de formamida soluciones, nutación para 10 min en cada solución.
   NOTA: Los ovocitos se asentarán más lento con porcentajes más altos de formamida.
3. Retire el líquido, a continuación, añadir la solución de formamida 500 l 50%, y de inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 a 5 horas.
   NOTA: El aumento de las incubaciones dan como resultado una mejor penetración de la sonda.
4. Retire el líquido, dejando tras de no más de ~ 100 ovocitos mu l, y añadir 36 l solución de hibridación más 2 l de sonda (50 ng / l) y 2 l de agua o 2 l de una sonda de 2 ^nd (Tabla 1).
5. Incubar a 91 ° C durante 3 min (FISH solamente) o 80 ° C durante 20 min (FISH además de inmunofluorescencia), seguido de incubación en un baño de agua a 37 ° durante la noche.
   NOTA: Estos pasos pueden llevarse a cabo en un termociclador.
6. No eliminar el líquido. Añadir 500 l 50% de solución de formamida y inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hr.
7. Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 50%, unad inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hora.
8. Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 20%, y de inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 10 min.
9. Realizar tres lavados rápidos en 500 l 2x ECSS (dejar reposar, desenchufar y añadir líquido, invertir varias veces, repetir.) Dejar reposar, eliminar el líquido, a continuación, añadir 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 4 horas.

8. tinción de anticuerpos después de FISH

1. Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir 10 l de anticuerpo anti-α-tubulina conjugado con FITC. Alternativamente, otros anticuerpos se pueden utilizar, siguiendo el protocolo anteriormente. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante la noche.
2. Lavar los ovocitos una vez durante 15 minutos con 500 l PTB, eliminar el líquido, a continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos.
3. Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 500 l PTB.
   NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento deformación de imágenes. Mantenga ovocitos en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido.

Repetir Nombre	Cromosoma	Oligo Secuencia *
359	x	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodecaedro	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1,686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 secuencia de Eric Joyce, comunicación personal, otras secuencias de Sullivan et al. 8

Tabla 1: sondas FISH para repeticiones centroméricas Drosophila.

Droga	Solvente	de la concentración	La concentración final	Tiempo de tratamiento	Efecto
colchicina	etanol	125 mM	150 M	10 min o 30 min	desestabilizar no cinetocoro (10 min) 9 o todos los microtúbulos (30 min)
paclitaxel	DMSO	10 mM	10 micras	10 minutos	estabilizar micrófonorotubules
Binucleine 2	DMSO	25 mM	25 M	20 minutos	inhibir la quinasa Aurora B 10

Tabla 2: El tratamiento con medicamentos.

Resultados

Los métodos que hemos descrito aquí, dará lugar a la colección de la última etapa de ovocitos Drosophila representan tres etapas de la meiosis (Figura 1). Los ovocitos en profase se distinguen por la presencia de la envoltura nuclear, que es visible por la falta de señal de la tubulina en la región que rodea el cariosoma (Figura 1A). Prometafase es el período posterior rotura de la envuelta nuclear durante el cual los ensambles de cabeza...

Discusión

Puesta en escena de Drosophila ovocitos

Aunque un cariosoma alargado se ve a menudo en los ovocitos prometaphase, utilizando cariosoma forma de distinguir a partir de ovocitos en metafase prometaphase puede ser problemático. Durante prometaphase, el cariosoma comienza como una forma redonda, se alarga, y se retira a una forma redonda como el ovocito se aproxima a la detención en metafase. Esto significa que muchos ovocitos prometaphase no tienen un cariosoma alarg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various