Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

I problemi più comuni nel trattamento dei campioni biologici per le osservazioni con il microscopio elettronico a scansione (SEM) includono il collasso delle cellule, il trattamento di campioni provenienti da microambienti umidi e la distruzione delle cellule. Utilizzando i giovani tessuti floreali, cisti oomiceti e spore di funghi (Agaricales) come esempi, i protocolli specifici per trattare i campioni delicati sono descritte qui che superano alcune delle principali sfide nel trattamento del campione per l'acquisizione di immagini sotto il SEM.

meristemi floreali fissate con FAA (formalina-acetico-alcol) ed elaborate con la Critical Point Dryer (CPD) non veniva visualizzato crollati pareti cellulari o organi distorti. Questi risultati sono cruciali per la ricostruzione dello sviluppo floreale. Un simile trattamento CPD-based dei campioni microambienti umidi, come le cisti oomiceti glutaraldeide fisso, è ottimale per testare la crescita differenziale di caratteristiche diagnostiche (ad esempio, le spine cisti) su diversi tipi di dobstrates. La distruzione delle cellule nutrici collegati a spore di funghi è stato evitato dopo la reidratazione, la disidratazione, e il trattamento CPD, un passo importante per ulteriori studi funzionali di queste cellule.

I protocolli descritti qui rappresentano a basso costo e le alternative rapide per l'acquisizione di immagini di buona qualità per ricostruire i processi di crescita e di studiare le caratteristiche diagnostiche.

In biologia, l'uso di microscopia elettronica a scansione (SEM) è stato esteso a studi di evoluzione strutturale, morfologia comparativa sviluppo degli organi, e la caratterizzazione di popolazioni o specie ^1. Con la sua vista bidimensionale di strutture microscopiche, aree come micromorfologia e sistematica beneficiato dal SEM tecnica progressi a partire dalla seconda metà del 20 ^° secolo. Ad esempio, l'introduzione della metodologia di rivestimento sputtering nel 1970 resa possibile osservazioni di materiali delicati quali apici dei germogli e fiori migliorando l'imaging del tessuto non conduttivi

NOTA: Questo protocollo comprende sei sezioni principali, tre dedicati ad organismi specifici (sezioni 1-3), e tre descrivono le procedure comuni a tutti (4-6). Asterischi (*) indicano passi modificati dagli sperimentatori.

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Sviluppo floreale e la fissazione di sviluppo e strutture vegetali completamente formato

Utilizzando il protocollo FAA-CPD descritto qui, giovani e mature tessuti vegetali sono perfettamente fissati e disidratati per l'imaging SEM. Processi come lo sviluppo floreale possono essere ricostruiti, perché la topografia e la forma delle gemme non sia falsata da cellule restringimento (Figure 1b, 1d, 4a-f). Le str.......

Per quanto riguarda i protocolli standard SEM, le procedure qui presentati sono relativamente rapido, facile da seguire, e le metodologie a basso costo. A seconda della quantità di campioni e sulla facilità di lavorazione, ci vogliono quattro o cinque giorni per acquisire immagini di buona qualità. Compreso adeguate misure di sicurezza per la CPD e il funzionamento SEM, le procedure sono facili da gestire. Particolare cautela deve essere assunto con formalina e la glutaraldeide (vedere i passaggi da 1.1.1 a 1.1.3 e 2.......

Questo progetto ha ricevuto un finanziamento dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione Europea con convenzione di sovvenzione n ° 634429. Questa pubblicazione riflette il punto di vista degli autori, e la Commissione Europea non può essere ritenuta responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni esso contenute. Abbiamo anche riconoscere il contributo finanziario da parte del Jardin Botanico, CSIC. SR è grata per l'Unione europea [ITN-SAPRO-238550] per il sostegno della sua ricerca in Saprolegnia. Vogliamo anche ringraziare Francisco Calonge per gentilmente fornire le immagini Herculanea Phellorinia....